Сотовый бесплатно Анализ по изучению хроматина деконденсацию в конце митоза

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы точно воссоздать конденсацию хроматина в том виде, в каком она происходит в конце митоза, в простоте бесклеточного анализа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования митоза, поскольку он позволяет охарактеризовать молекулярный механизм хроматина, деколонизации и идентифицировать фактор, участвующий в регуляции. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с ней можно легко биохимически манипулировать и хроматином.

Деколонизацию можно изучать изолированно, отдельно от других событий клеточного цикла. Для начала выделите кластеры митотического хроматина из хелоклеток и подготовьте буферы для получения экстракта яиц IIC xenopus lavis, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. После приготовления используйте пятимиллилитровый шприц, оснащенный иглой 27 калибра, чтобы ввести 500 международных единиц хорионического гонадотропина человека лягушкам, индуцированным овуляцией.

Введите лягушкам под кожу дорсального лимфатического мешка вечером накануне эксперимента, чтобы вызвать выброс яиц После индуцирования держите лягушек при температуре 18 градусов Цельсия в течение 13-17 часов в отдельных резервуарах, содержащих 1,2 литра модифицированного буфера Марка. После того, как лягушки отложат яйца, удалите уже активированные яйца вместе с любыми плохо выглядящими яйцами. Соберите их, разлив баки в стеклянные стаканы объемом от 600 до 1000 миллилитров Правильно.

Сортировка яиц имеет решающее значение, так как общее дополнительное качество зависит от этапа. Удалите активированные, волокнистые и в остальном плохо выглядящие яйца. Также на более поздних этапах продолжайте удалять плохие яйца.

Сцедите надосадочную жидкость S, как только яйца осядут, а затем наполните стакан свежим буфером. Повторите этот процесс четыре раза, чтобы вымыть яйца после последней промывки. Удалите супинат еще раз, а затем заполните стакан 2%-ным раствором цистеина, чтобы разграничить яйца.

Через две-четыре минуты перейдите на свежий буфер, содержащий L-цистеин. Считайте, что дегелинг завершен, когда объем икринок резко уменьшается и икринки становятся более плотно упакованными примерно через пять-семь минут. Затем тщательно промойте яйца в модифицированном буфере Марка, сцедив и наполнив буфер супинатом на стенке стакана, а не непосредственно на яйца.

Затем активируйте яйца в 100 миллилитрах модифицированного Марксом буфера, содержащего восемь микролитров по два миллиграмм на миллилитр. Ионы кальция. В-четвертых, прекращайте активацию, когда сокращение шапки животного становится заметным.

Или через 10 минут после активации тщательно промойте яйца в модифицированном звонке Марка, буфере путем сцеживания и повторного заполнения буфера супинатом после последней промывки. Инкубируйте яйца при комнатной температуре в течение 20 минут в модифицированном буфере Марка. Далее приготовьте пятимиллилитровые центрифужные пробирки с 50 микролитрами сахарозного буфера, 50 микролитрами 100-кратного ингибитора протеазы.

Смешайте пять микролитров одного моляра DTT, 12,5 микролитров циклохейда и 2,5 микролитра цито. Б. Дважды промойте яйца холодным буфером из сахарозы, а затем переложите их в центрифужные пробирки. С помощью пластиковой пастбищной пипетки с широким отверстием упакуйте яйца, вращая пробирки в течение одной минуты при температуре 130 G. После центрифугирования удалите излишки буфера с помощью пластиковой пастбищной пипетки и заполните дополнительное помещение большим количеством яиц.

Затем центрифугируйте заполненные яйцом пробирки в качающемся роторе размером шесть на пять миллилитров в течение 20 минут при температуре 4 градуса Цельсия и 21 000 раз больше избытка. Разделив раствор на три слоя, протолкните пятимиллилитровый шприц с иглой 16 калибра через боковую сторону трубки в средний слой между желтым желтком сверху и чуть выше темных разбитых обломков яиц внизу. Переложите низкоскоростной фазовый экстракт в свежую пробирку на льду, а затем добавьте 10 микролитров 100-кратного ингибитора протеазы.

Смешайте один микролитр одного моляра DTT с 2,5 микролитрами циклохейда в дозе 20 мг на миллилитр и 0,5 мкл цито В. Добавьте 10 мкг на миллилитр на каждый миллилитр низкоскоростного экстракта. Вращайте низкоскоростной фазовый экстракт в течение 12 минут при 355 000 умноженных на G в роторе размером 10 на два миллилитра. Затем аккуратно снимите липидный слой сверху и переложите супинат, содержащий экстракт высокой скорости, в свежую пробирку.

Этот шаг имеет решающее значение для производства высококачественного образца. Следите за тем, чтобы удаленная жидкость не содержала загрязнений от липидного слоя сверху или раздражающего нижнего слоя. Пипеткой нанесите 18 микролитров высокоскоростного экстракта в реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитров, а затем добавьте 0,5 микролитра гликогена и 0,5 микролитра энергетической смеси.

Пункт третий, микролитры шести диметилпуринов и 0,7 микролитра митотических кластеров. Используйте наконечники с широким отверстием для перемешивания реакции, как только хроматин будет добавлен, чтобы предотвратить сдвиг декомпенсирующего хроматина. После смешивания инкубируйте реакционную смесь в течение двух часов при температуре 20 градусов Цельсия.

Затем зафиксируйте образец, добавив 0,5 миллилитров ледяного фиксатора, содержащего 4% паральдегида, 0,5% глутаральдегида и 0,1 миллиграмм на миллилитр DPI. С помощью наконечников с широким отверстием инкубируйте образец на льду в течение 20 – 30 минут. Затем закодируйте 12-миллиметровые круглые покровные листы 0,1%-ным массовым раствором поли-л лизина и инкубируйте покровные листы в течение пяти минут, чтобы увеличить сродство к покровным стеклам.

Чтобы хроматин высох, крышка после этого наклеивается на фильтровальную бумагу. После высыхания добавьте покрытую крышку на дно шестимиллилитровых пробирок для центрифугирования с плоским дном так, чтобы сторона с покрытием была вверху. Затем добавьте 800 микролитров 30%-ной сахарозной подушки и сверху нанесите весь фиксированный образец.

Вращайте образец в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и 2,500 градусах Г. Затем удалите надосадочную жидкость S и снимите защитные стекла с пробирок, осторожно проткнув дно центрифугирующей трубки иглой 16 калибра. Когда покровное стекло будет поднято иглой с одной стороны, используйте пинцет, чтобы удалить покровное покрытие, быстро промойте покровное покрытие, погрузив его в деионизированную воду, а затем осторожно высушите, коснувшись его боковой стороной фильтровальной бумаги. Затем поместите каплю монтажного материала на предметное стекло микроскопа и опустите крышку со стороны образца.

Наденьте на монтажный носитель. Аккуратно высушите чехолочный лист бумажной салфеткой, запечатайте по краю чехла-чехла лаком для ногтей и держите слайд в темноте, пока он не будет изображен. Вот типичный временной ход анализа декомпенсации.

Кластер хромосом, видимый в начале реакции, деконсируется, конденсируется и сливается в единое круглое и гладкое ядро. Когда экстракт яйца заменяется буфером из сахарозы, кластер хромосом остается конденсированным, что говорит о том, что в экстракте яйцеклеток присутствует декомпенсационная активность. В показанном здесь эксперименте в реакцию были добавлены негидролизованные аналоги A TP или GTP.

Обе эти добавки ингибируют деконденсацию, доказывая, что этот активный процесс зависит как от гидролиза A TP, так и от GTP. После освоения этой техники она может быть выполнена примерно за два часа для приготовления экстракта яиц на сингапурском уровне и за три часа для анализа на стимулирование деколонизации. При проведении этой процедуры важно помнить, что успех в решающей степени зависит от качества экстракта.

Особенно при ослаблении иммунитета рекомендуется использовать свежеприготовленный экстракт после этой процедуры. Другие методы, такие как истощение иммунитета и добавление рекомбинантных белков, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие факторы вовлечены. Этот метод проложит путь исследователям в области митоза или структуры и функции ядра для изучения дегуманизации хроматина, как это происходит в конце митоза в клетках животных.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как готовить экстракты яиц печени ex xenopus и как применять метод восстановления деколонизации хроматина. Не забывайте, что работа с Paraform Hyde, Hyde и DARPA может быть опасной, поэтому следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.