Вода в масле: Новая система для сборки растворимых в воде Хлорофилл-связывающих белков с гидрофобными Пигменты

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы обеспечить включение нерастворимых в воде хлорофиллов в места связывания водорастворимых белков. Этот метод позволяет собирать хлорофиллы с рекомбинантными белками, что позволяет проводить тщательные исследования хлорофилл-белковых взаимодействий и открывает новые возможности для построения новых хлорофилл-белковых комплексов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она не требует маркировки или иммобилизации белков.

Таким образом, он хорошо подходит для скрининговых анализов. Демонстрировать процедуру будет Доминика Беднарчик, постдок в моей исследовательской группе. Во время приготовления следующих исходных растворов выполняйте все этапы приготовления хлорофилла под химическим колпаком под зеленым светом или в темноте, чтобы свести к минимуму фотоповреждения.

Всегда добавляйте азот или аргон перед замораживанием пигментов для хранения и убедитесь, что все растворители являются аналитическими. Для начала взвесьте около пяти граммов лиофилизированных клеток Spirulina platensis или других клеток цианобактерий, содержащих только хлорофилл а или хлорофилл-а в тилакоидных мембранах, и используйте ступку и пестик, чтобы измельчить их. Критическим этапом во время экстракции хлорофилла является обеспечение тщательной лиофилизации клеток цианобактерий и полное удаление воды из ДЭАЕ-сефарозы путем нескольких промываний ацетоном.

Загрузите измельченные клетки на стеклянную колонку и примерно 50-100 миллилитрами 100% ацетона промойте ткань, чтобы удалить каротиноиды. После стирки выбросьте элюированную оранжево-зеленую фракцию. Фактический цвет может варьироваться от оранжево-зеленого до зеленого в зависимости от культуры цианобактерий и условий произрастания.

Замените ацетон на 100% метанол и соберите зеленую фракцию, содержащую хлорофилл а. Когда цвет элюированной фракции превратится из темно-зеленого в бледно-зеленый, прекратите элюирование. Далее с помощью ротационного испарителя с водяной баней, температура которой не превышает 30 градусов Цельсия, выпарить метанол до полного высыхания экстракта, затем использовать небольшой объем диэтилового эфира для полного растворения пигментов из высушенных экстрактов и отфильтровать раствор через вату, используя дополнительно небольшой объем эфира для смывания пигментов с ваты.

Выпаривайте диэтиловый эфир до полного высыхания пигментов. Если на этом остановиться, держите сухие пигменты под азотом или аргоном при температуре 20 градусов Цельсия в темноте до дальнейшей обработки. Чтобы поступить с хлорофиллом, препаратом частично растворите сухие пигменты в минимально возможном объеме 100% ацетона, затем добавьте 4 миллилитра ацетона в суспензию и взболтайте колбу до полного растворения пигментов.

С помощью пастеровской пипетки аккуратно загрузите образец на колонку DEAE-сефароза, уравновешенную 100% ацетоном, и с помощью 100% ацетона элюируйте каротиноиды. Затем используйте смесь ацетона и метанола в соотношении 3:1 по объему для элюирования хлорофилла а. Вы можете использовать фонарик, чтобы кратковременно осветить колонку во время элюирования, чтобы наблюдать за фактическими цветами пигмента.

С помощью тонкослойной хроматографии проверьте чистоту хлорофилла, используя соотношение объема к объему дихлорметана и гексана, изопропанола и метанола в соотношении 68:25:5:2 для элюирования образца. Затем с помощью ротационного испарителя выпарить растворитель до полного высыхания хлорофилла. Для приготовления хлорофилла в исходном растворе повторно растворите сухой хлорофилл А в 2-4 миллилитрах 100% метанола.

Для приготовления органической фазы эмульсии в 50-миллилитровую тубу весят 0,2 грамма Твин 80, 1,8 грамма Спана 80 и 38 грамм минерального масла. Хорошо перемешайте компоненты и поместите раствор на лед для остывания. Чтобы получить водную фазу, содержащую очищенный водорастворимый хлорофилл-связывающий белок, или WSCP, вырастите бактерии E.coli BL21, содержащие ген WSCP, в 1 литре среды LB при температуре 37 градусов Цельсия до OD600 от 0,3 до 0,6.

Добавьте 1 миллимолярный IPTG, чтобы вызвать экспрессию белка, и выращивайте бактерии при 30 градусах Цельсия в течение 12-16 часов, затем соберите бактерии путем центрифугирования при 5000 G и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. С помощью буфера, подходящего для аффинной хроматографии, растворяют гранулы, переносят бактериальную суспензию в более мелкие пробирки и обрабатывают ультразвуком на льду. После замедления лизата очистите рекомбинантные меченые белки WSCP с использованием соответствующей коммерчески доступной системы аффинной хроматографии для очистки белков в соответствии с инструкциями производителя.

Приготовьте водную фазу эмульсии, заменив буфер на 50 миллимолярный фосфатный буфер pH 7,8 и доведя концентрацию очищенного WSCP до 0,5-1 миллиграмма на миллилитр. Чтобы получить водную фазу, содержащую неочищенный бактериальный лизат с WSCP, вырастите клетки E.coli BL21, содержащие плазмиду, экспрессирующую WSCP в 250 миллилитрах LB при 37 градусах Цельсия до логарифмической фазы. Добавьте 1 миллимоляр IPTG, чтобы вызвать экспрессию белка, и выращивайте бактерии при температуре 30 градусов Цельсия в течение ночи.

На следующий день, после сбора урожая, бактериальные клетки используют 1-2 миллилитра 50 миллимолярного буфера фосфата натрия pH 7,8 для растворения гранулы. Затем, после ультразвукового воздействия, центрифугируйте лизат при 12 000 G и 4 градусах Цельсия в течение 30 минут. Приготовьте водную фазу эмульсии, смешав 0,125 миллилитров надосадочной жидкости с 0,875 миллилитрами 50 миллимолярного буфера фосфата натрия pH 7,8.

Чтобы собрать WSCP с хлорофиллом А в эмульсии, перелейте 5 миллилитров тщательно перемешанной смеси масла и поверхностно-активного вещества в стеклянный флакон и охладите на льду. Добавьте 1 миллилитр только что приготовленной ледяной водной фазы и используйте тканевый гомогенизатор при 9 500 об/мин на льду в течение двух минут, чтобы смешать обе фазы. С этого момента и далее, выполняя все действия под зеленым светом для минимизации фотоповреждений, добавьте в эмульсию 20 микролитров 25 миллимолярного хлорофилла стокового раствора.

Диспергируйте путем переворачивания и переворачивания стеклянного флакона, следя за тем, чтобы хлорофилл а равномерно распределился в эмульсии, затем выдерживайте на льду в темноте в течение 1-2 часов. Критическим этапом при приготовлении эмульсии является охлаждение как водной, так и органической фазы перед смешиванием. Далее, чтобы разрушить эмульсию и отделить капли воды от органической фазы, переложите эмульсию в 1,5-миллилитровые пластиковые пробирки и центрифугируйте при 14 000 G при комнатной температуре в течение пяти минут.

Утилизируйте верхнюю масляную фазу и добавьте 1 миллилитр минерального масла в нижнюю фазу, затем хорошо перемешайте, завихрив или перевернув трубку. После вращения образца удалите верхнюю масляную фазу и повторите добавление минерального масла и центрифугирование до тех пор, пока не будет достигнут прозрачный мениск, разделяющий водную и минеральную фазы масла без промежуточной эмульсии. Теперь в водную фазу добавьте 1 миллилитр насыщенного водой диэтилового эфира.

Затем, после вортексирования образца, закрутите его при 14 000 G в течение 5 минут при комнатной температуре. После третьего центрифугирования, в колпак, извлеките диэтиловый эфир и оставьте пробирки открытыми на 5-20 минут. Наконец, загрузите водную фазу, содержащую комплекс WSCP-хлорофилл А, в обессоливающую колонну и разбавьте буфером, подходящим для будущих экспериментов.

Храните образец при температуре 4 градуса Цельсия вдали от света в течение одного месяца. Используя протокол, описанный в этом видео, рекомбинантные апопротеины WSCP были собраны с хлорофиллом а в воде и масляных эмульсиях. Здесь показаны абсорбционные способности и спектры CD комплексов хлорофилла а с четырьмя рекомбинантными вариантами WSCP.

Результаты схожи в полосном конечном положении с ранее зарегистрированными спектрами соответствующих нативных комплексов. На этом рисунке показана положительная сборка WSCP с хлорофиллом а в лизатах из клеток, экспрессирующих WSCP, как видно по зеленому цвету водной фазы. Этот результат демонстрирует потенциал водных и масляных эмульсий в качестве системы быстрого скрининга для положительной сборки WSCP с хлорофиллами.

Как показано здесь, капли WSCP-содержащих лизатов имеют отчетливый хлорофилл — флуоресценцию на изображениях конфокального микроскопа. Это означает, что успешная сборка комплексов WSCP-хлорофилл может быть обнаружена непосредственно в каплях воды, и это может послужить основой для систем скрининга на основе воды и масляной эмульсии. После освоения этой техники ее можно выполнять в течение пяти часов, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что работа с хлорофиллами должна выполняться быстро, не подвергая хлорофилл воздействию света и кислорода. После его разработки этот метод позволил нам получить широкий спектр водорастворимых хлорофилл-связывающих белков, которые используются для изучения влияния белковой среды на электролитические и спектральные свойства хлорофиллов. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как извлечь и очистить хлорофиллы из цианобактерий и собрать их в водорастворимые белки с помощью водных и масляных эмульсий.

Не забывайте, что работа с органическими растворителями, такими как эфир, метанол или ацетон, может быть вредной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в химической вытяжке.