Оптимизация раны царапинам анализе для обнаружения изменений в мышиной мезенхимальных стромальных клеток миграции после повреждения по растворимый экстракт сигаретного дыма

Общая цель этого анализа заключается в выявлении изменений миграционной способности мезенхимальных стромальных клеток легких после повреждения растворимым экстрактом сигаретного дыма. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области регенеративной биологии легких, в том числе на вопрос о том, как можно улучшить миграционную способность клеток-предшественников легких, чтобы помочь в восстановлении легких. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он был оптимизирован для обеспечения более точных количественных измерений миграции клеток, оставаясь при этом экономичным в выполнении и простым в настройке.

В этой демонстрации скретч-анализ будет использоваться для количественной оценки миграционной способности мезенхимальных стромальных клеток мышиного легкого, или МСК. После воздействия растворимого экстракта сигаретного дыма МСК выращивают в сплошной среде на 60-миллиметровых планшетах и повреждают, как описано в тексте протокола. Для анализа царапин важно правильное слияние, поскольку оно гарантирует, что программное обеспечение для визуализации сможет правильно определить границы царапины.

В этом примере показаны МСК при 95% конфлюенции, подходящей для расчесывания в стерильной среде. Снимите крышку с тарелки с поврежденными МСК и положите прямой край, например, стерилизованную пластиковую линейку, на верхний край тарелки. Прямая кромка сводит к минимуму количество регулировок вращения, необходимых для пластины, когда она позже помещается на предметный столик микроскопа для визуализации.

Не удаляя фильтрующий материал, используйте стерильный наконечник для дозатора объемом 200 микролитров, направляемый по стерильному прямому краю, чтобы сделать четыре параллельные царапины на пластине на расстоянии примерно пяти миллиметров друг от друга и длиной 50 миллиметров. Создание множественных царапин на 60-миллиметровой пластине не изменяет микроокружение таким образом, чтобы повлиять на миграцию клеток для МСК, но может быть рассмотрено для других типов клеток. Отсадите среду и аккуратно промойте пластину двумя миллилитрами предварительно подогретой готовой среды.

Это предотвращает прилипание клеток к центру царапины и удаляет клетки, которые были ослаблены в результате царапины. Замените четыре миллилитра свежего готового материала с помощью стерильного перманентного маркера, нанесите на каждую царапину от одной до четырех на нижней стороне пластины в местах, которые не будут мешать визуализации. Необходимо сделать исходные изображения царапин для каждой царапины, так как важно, чтобы изображения с одной и той же царапины сравнивались до и после миграции, так как ширина царапин может различаться.

Если анализ царапин проводится на нескольких пластинах, рекомендуется сделать первоначальные изображения всех царапин на одной пластине, прежде чем делать царапины на следующей пластине. Используйте инвертированный фазово-контрастный микроскоп с камерой для получения изображений, необходимых для анализа. Расположите планшет с культурой на микроскопе и используйте объектив с низким энергопотреблением, чтобы найти царапину.

Номер один. Крайне важно, чтобы царапина отображалась на экране полностью горизонтально, при этом царапина оставалась полностью горизонтальной и находилась в центре поля зрения, чтобы получить столько изображений, сколько необходимо, чтобы охватить 90% длины царапины. Получение изображений из отдельных частей царапины без наложения между изображениями.

Не делайте снимки с первого и последнего 5% длины царапины, потому что преломление света по краям чашки для культуры приводит к экспонированию изображений, что делает их невозможным для анализа. Сохраняйте изображения с нуля, номер один в папке. Таким же образом получайте изображения для второй, третьей и четвертой царапин и сохраняйте изображения для каждой царапины в отдельной папке.

Верните планшеты в инкубатор сразу после этой первичной визуализации. Дайте клеткам мигрировать в течение четырех-семи часов перед началом этого анализа. Загрузите программное обеспечение Image J и установите плагин инструмента для заживления ран.

Откройте файл изображения на изображении J, затем нажмите «Обработать» и найдите края, чтобы выделить клетки, окружающие царапину, для инструмента для заживления ран. Чтобы рассчитать рабочую зону, нажмите «Настройка изображения» и «Порог цвета», а затем в выпадающем меню с надписью «Цвет порога» измените значение на BNW в меню цветового порога. Переместите нижний ползунок полностью вправо, чтобы сделать изображение полностью черным, а затем отрегулируйте верхний ползунок, чтобы создать максимальный контраст между царапиной и лицевой стороной ячейки.

Медленно отрегулируйте верхний ползунок яркости слева направо, пока на изображении не будет четко отображен контур царапины. После того как края царапины будут определены, нажмите «Дополнительные инструменты». На панели инструментов изображения J выберите инструмент для заживления ран МРТ из выпадающего меню и нажмите кнопку M, чтобы выделить область царапины и вывести вычисленную площадь.

Во всплывающем окне результатов скопируйте и вставьте все числа из окна результатов в таблицу Excel. Убедитесь, что данные отделены от отдельных царапин. После того как клетки мигрировали в течение четырех-семи часов, повторите процедуру получения изображения для царапин на пластинах в том же порядке, в котором они были поцарапаны, чтобы у клеток на каждой пластине было одинаковое время для миграции.

Клетки могут быть визуализированы в нескольких временных точках в зависимости от их чувствительности к изменениям температуры и pH. Затем окончательные скретч-изображения анализируются с помощью Image J таким же образом, как это было показано для исходных скретч-изображений. Области царапин также могут быть рассчитаны для количественной оценки миграции, правильно.

Слияние имеет решающее значение для успеха анализа царапин. Здесь показано успешное соскоб МСК легких мышей при 95% слиянии. Напротив, 70%-ное слияние слишком мало для успешного скретча и может привести к образованию ложных границ.

Это репрезентативные исходные изображения до и после миграции с соответствующими границами областей царапин, определенными программным обеспечением для обработки изображений. Эти графики показывают среднюю рассчитанную площадь царапин в пикселях для каждой из четырех царапин, сделанных на пластине МСК мышиного легкого при 95% слиянии до или после миграции с воздействием 0% или 4% экстракта сигаретного дыма. Сравнение расчетного среднего изменения площади царапин выявило меньшую миграцию МСК легких мышей после воздействия 4%-ного экстракта сигаретного дыма.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить об оптимизации и тщательном мониторинге слияния клеток для конкретного типа клеток, с которыми мы работали, и практиковаться в создании царапин, чтобы убедиться, что они максимально однородны. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы об изменениях и экспрессии белков, которые могут повлиять на миграцию клеток.