Метаболический характеристика поляризованных M1 и M2 из костного мозга макрофагов, используя анализ в реальном времени внеклеточной Flux

Общей целью данного анализа внеклеточного потока является оценка метаболических характеристик наивных макрофагов M1 и M, двух поляризованных микрофагов, полученных из костного мозга. Этот метод может служить основой для исследования того, как определенные цитокины, соединения или генокоды влияют на метаболический фенотип макрофагов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что для нее требуется лишь небольшое количество макрофагов.

Кроме того, он измеряет все соответствующие гликолиз и митохондриальные параметры в одном анализе. Хотя этот метод дает представление о метаболическом фенотипе макрофагов, полученных из костного мозга, он также может быть применен ко всем типам макрофагов или иммунных клеток. У нас возникла идея опубликовать этот метод в J, так как мы часто получаем просьбы от других ученых помочь им с анализами метаболического доступа к клеточному потоку: на восьмой день культивирования проверьте наличие зрелых макрофагов с помощью визуального осмотра и инкубируйте зрелые макрофаги, полученные из костного мозга, в 10 миллилитрах цитратного физиологического раствора в течение пяти минут.

37 градусов по Цельсию, когда клетки отделились. Промойте культуру 10 миллилитрами PBS и подсчитайте количество жизнеспособных клеток. Затем засейте пять раз по 10 до четвертой ячейки в лунку.

В культуре клеток XFE 96 микропланшет в 100 микролитрах питательной среды на лунку, держа пипетку под углом примерно на полпути вниз по стене каждой лунки. Чтобы распределить ячейки, добавьте только среду в лунки коррекции фона А 1, А 12, Н 1 и Н 12. Затем дайте клеткам отстояться при комнатной температуре в шкафу для клеточных культур в течение одного часа.

После подтверждения приверженности культивированию, клетки помещают в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия 5% углекислым газом. Через три часа после осаждения стимулируйте от четырех до шести лунок клеток для каждого состояния в зависимости от необходимости в течение 24 часов. Чтобы поляризовать макрофаги, полученные из костного мозга, за день до анализа внеклеточного потока поместите картридж датчика вверх дном рядом с рабочей пластиной и заполните каждую пластину 200 микролитрами кринового раствора.

Затем опустите картридж датчика на электрическую пластину, чтобы погрузить датчики в раствор Каина, и убедитесь, что уровень раствора Каина достаточно высок, чтобы удерживать датчик под водой. Затем поместите картридж в инкубатор без углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день аккуратно удалите надосадочную жидкость из поляризованных макрофагов и промойте клетки 100 микролитрами свежеприготовленного анализа.

Средний на лунку. Добавьте в каждую лунку по 180 микролитров провизионной среды, и с помощью микроскопа убедитесь, что клетки не были смыты. Если клетки все еще прикреплены, поместите планшет в инкубатор без углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия на один час до проведения анализа, пока клетки инкубируются.

Приготовьте 10 смесей для инъекций, как указано в таблице, и нагрейте смеси до 37 градусов Цельсия. Затем загрузите в сенсорный картридж соответствующие объемы соединения и порты A, B, C и D, используя прилагаемые руководства по загрузке, чтобы охарактеризовать биоэнергию поляризованных макрофагов с помощью анализа внеклеточного потока. Используйте мастер анализа для создания шаблона анализа с двухминутным временем смешивания и трехминутным измерением, а также не менее трех циклов измерения смешивания и скорости перед каждой из четырех инъекций и после последней инъекции.

Затем начните анализ и следуйте инструкциям, указанным на приборе. Загрузка картриджной пластины гидратированными зондами для обеспечения калибровки устройством и пластиной ячейки. Получив указание, в конце анализа тщательно выбросьте всю среду для анализа и храните микропланшет анализируемой клеточной культуры при температуре минус 20 градусов Цельсия до нормализации.

Чтобы нормализовать клетки с помощью набора для анализа пролиферации клеток, разморозьте планшет и инкубируйте клетки в 200 микролитрах свежеприготовленного буфера для лизиса клеток в лунку в течение пяти минут при комнатной температуре. Наконец, измерьте флуоресценцию с возбуждением около 480 нанометров и максимумами излучения около 520 нанометров. Используя полученные флуоресцентные измерения, можно рассчитать соотношение, при котором среднее количество клеток всех наивных макрофагальных лунок установлено равным единице, затем экспортировать эти соотношения в программное обеспечение для анализа волн Seahorse.

Чтобы нормализовать данные, анализ внеклеточного потока обычно дает скорость внеклеточного закисления или скорость ЭКАР и потребления кислорода, или графики OCR, как показано на этом репрезентативном рисунке, после инъекции глюкозы наблюдаемое увеличение ЭКАР представляет скорость гликолиза. Дополнительное увеличение, наблюдаемое в ЭКАР после ингибирования ТП-синтазы всеми лигамицинами, дает дополнительную информацию о гликолитическом резерве и емкости. При анализе значений OCR инъекция CIN облегчает расчет потребления кислорода, используемого для синтеза митохондриального A TP, FCCP разъединяет митохондриальное дыхание.

Соответствующие измерения OCR дают данные о максимальной и резервной дыхательной способности известной гнили и инъекции антимицина а, однако блокируют митохондриальные комплексы один и три, при этом остаточный OCR представляет собой немитохондриальное потребление кислорода. Активация макрофагов с помощью ЛПС индуцирует повышенный гликолитический метаболизм. При различиях между ЛПС и ИЛ четыре обработанных макрофага становятся еще более очевидными, когда наблюдаются скорости потребления кислорода.

Действительно, в то время как максимальный окислительный метаболизм сильно подавлен в макрофагах, обработанных ЛПС, IL 4 индуцирует сильное дыхание в М-двух макрофагах. После освоения анализ на внеклеточный грипп может быть завершен за два часа, если он выполнен правильно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о введении ветеринарного препарата вместе с FCCP, чтобы обеспечить максимальное дыхание после разъединения.

После использования этого метода можно провести дополнительные анализы, такие как Элиза, для оценки эффективной поляризации макрофагов. Этот метод проложил путь исследователям из области иммунологии к изучению метаболических характеристик широкого спектра иммунных клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить анализ внеклеточного потока для оценки метаболического фенотипа макрофагов.