Метаболический характеристика поляризованных M1 и M2 из костного мозга макрофагов, используя анализ в реальном времени внеклеточной Flux

Общая цель данного анализа внеклеточных потоков заключается в оценке метаболических характеристик наивных, а также поляризованных по типу M1 и M2 макрофагов, полученных из костного мозга. Этот метод может служить основой для исследования того, как определенные цитокины, соединения или генотипы влияют на метаболический фенотип макрофагов. Основным преимуществом данной методики является то, что для неё требуется лишь небольшое количество макрофагов.

Более того, этот метод позволяет измерить все значимые параметры гликолиза и митохондриальной функции в рамках одного анализа. Хотя данный метод дает представление о метаболическом фенотипе макрофагов костного мозга, он также может быть применен ко всем типам макрофагов или иммунных клеток. Мы решили опубликовать этот метод в J, так как часто получаем запросы от других ученых об оказании помощи в проведении анализов клеточного метаболического потока. На восьмой день культивирования убедитесь в наличии зрелых макрофагов путем визуального осмотра и инкубируйте зрелые макрофаги костного мозга в 10 мл цитратного физраствора в течение пяти минут.

Выдержите при 37 °C до тех пор, пока клетки не открепятся. Промойте культуру 10 мл PBS и подсчитайте количество жизнеспособных клеток. Затем высейте по 5 × 10⁴ клеток на лунку.

В микропланшет для культур клеток XFE 96 внесите по 100 µL культуральной среды в каждую лунку, удерживая пипетку под углом примерно на половине высоты стенки каждой лунки. Для распределения клеток добавьте только среду в лунки для коррекции фона: A1, A12, H1 и H12. Затем дайте клеткам осесть при комнатной температуре в ламинарном шкафу для культур клеток в течение одного часа.

После подтверждения адгезии культуры клетки помещают в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. Через три часа после посева соответствующие четыре-шесть лунок с клетками для каждого условия стимулируют в течение 24 часов. Для поляризации макрофагов, полученных из костного мозга, за день до проведения анализа внеклеточного потока (extracellular flux assay) сенсорный картридж помещают вверх дном рядом с вспомогательной планшетой и заполняют каждую лунку планшета 200 µL раствора крина.

Затем опустите картридж с датчиками на вспомогательную пластину, чтобы погрузить датчики в раствор Кейна, и убедитесь, что уровень раствора Кейна достаточно высок для полного погружения датчика. Затем поместите картридж в инкубатор при 37 °C без содержания диоксида углерода на ночь. На следующий день аккуратно удалите супернатант с поляризованных макрофагов и промойте клетки 100 µL свежеприготовленного реагента для анализа.

Среда на лунку. Добавьте 180 µL assay medium в каждую лунку и с помощью микроскопа убедитесь, что клетки не были смыты. Если клетки остаются прикрепленными, поместите планшет в инкубатор без подачи CO2 при 37 °C на один час перед началом анализа для инкубации клеток.

Подготовьте 10 смесей соединений для инъекций согласно указаниям в таблице и нагрейте смеси до 37 °C. Затем заполните картридж датчика соответствующими объемами соединений в портах A, B, C и D, используя provided loading guides, чтобы охарактеризовать биоэнергетику поляризованных макрофагов с помощью анализа внеклеточного потока. Используйте мастер анализа для создания шаблона анализа с временем перемешивания две минуты и временем измерения три минуты, а также как минимум три цикла перемешивания и измерения скорости перед каждой из четырех инъекций и после последней инъекции.

Затем запустите анализ и следуйте инструкциям, указанным на приборе. Загрузите картриджную пластину с гидратированными зондами для калибровки прибора и пластины с клетками. По завершении анализа, когда поступит соответствующая команда, осторожно удалите всю анализ-среду и храните микропластину с проанализированной клеточной культурой при температуре -20 °C до проведения нормализации.

Для нормализации клеток с помощью набора для анализа пролиферации клеток разморозьте планшет и инкубируйте клетки в 200 µL свежеприготовленного буфера для лизиса клеток на лунку в течение пяти минут при комнатной температуре. Наконец, измерьте флуоресценцию при максимумах возбуждения около 480 nm и эмиссии около 520 nm. Используя полученные значения флуоресценции, рассчитайте соотношение, при котором среднее количество клеток во всех лунках с наивными макрофагами принимается за единицу, затем экспортируйте эти соотношения в программное обеспечение Seahorse Wave для анализа.

Для нормализации данных: анализ внеклеточного потока обычно дает графики скорости внеклеточного закисления (ECAR) и скорости потребления кислорода (OCR), как показано на этом репрезентативном рисунке; наблюдаемое после введения глюкозы повышение ECAR отражает скорость гликолиза. Дополнительный рост ECAR, наблюдаемый после ингибирования ТР-синтазы с помощью олигомицина, дает дополнительную информацию о гликолитическом резерве и емкости. При анализе значений OCR введение CIN облегчает расчет потребления кислорода, используемого для синтеза митохондриального АТФ, а FCCP разобщает митохондриальное дыхание.

Соответствующие измерения OCR позволяют получить данные о максимальной и резервной дыхательной способности; при этом введение антимицина А блокирует митохондриальные комплексы I и III, и остаточный OCR представляет собой немитохондриальное потребление кислорода. Активация макрофагов с помощью LPS вызывает усиление гликолитического метаболизма. Различия между макрофагами, обработанными LPS и IL-4, становятся еще более выраженными при анализе скорости потребления кислорода.

Действительно, в то время как максимальный окислительный метаболизм сильно подавлен в макрофагах, обработанных LPS, IL-4 индуцирует интенсивное дыхание в макрофагах M2. После освоения метода анализ внеклеточного потока может быть завершен за два часа при условии правильного выполнения. При проведении данной процедуры важно помнить о необходимости введения VET вместе с FCCP для обеспечения максимального дыхания при разобщении.

После применения данной методики можно провести дополнительные анализы, такие как ELISA, для оценки эффективности поляризации макрофагов. Этот метод открыл исследователям в области иммунологии возможность изучать метаболические характеристики широкого спектра иммунных клеток. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как проводить анализ внеклеточного потока для оценки метаболического фенотипа макрофагов.