Улучшена генерация индуцированной кардиомиоцитов Использование полицистронных Construct выражая оптимальное соотношение GATA4, MEF2C и Tbx5

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать, как эффективно генерировать индуцированные кардиомиоциты из сердечных фибробластов с помощью полиционической конструкции MGT, выражающей оптимальное соотношение gata four, F two C и TBX five. Этот метод обеспечивает ценную платформу для исследования индуцированных кардиомиоцитов и будет способствовать постскрининговым и механистическим исследованиям программирования индуцированных кардиомиоцитов, а также расширит область клинических применений. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с помощью всего одной ретровирусной конструкции кардиофибробласты могут быть эффективно преобразованы в кардиомиоциты.

Очистите неонатальную мышь с тяжелой цепью альфа-миозина GFP до 75% объема. Этанолом проводят эвтаназию. Затем откройте полость тела, сделав горизонтальный разрез от одной подмышечной впадины к другой с помощью стерильных, тупых и согнутых щипцов.

Разрежьте сердце и поместите его в одну лунку из 24-луночной тарелки со льдом. При холодных PBS наблюдают за экспрессией GFP по всему сердцу с помощью флуоресцентной микроскопии. Поместите от трех до 4G FP положительных сердец в 60-миллиметровую чашку для культивирования с помощью стерильных щипцов и ножниц, измельчите сердечки на мелкие кусочки размером менее одного кубического миллиметра.

Переложите измельченные сердечки в 10-сантиметровую посуду и залейте двумя миллилитрами фибрблабла или среды FB. Оставьте пластины в покое не менее чем на три часа в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации медленно добавьте восемь миллилитров предварительно подогретой среды FB в блюдо, содержащее измельченную сердечную ткань.

Затем инкубируйте ткань без нарушений, за исключением смены среды каждые три дня. На седьмой день аспирируйте питательную среду и промойте клетки DPBS. Добавьте три миллилитра 0,05% трипса в ЭДТА на каждую тарелку и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Добавьте пять миллилитров среды FB, чтобы деактивировать трипсин, а затем аккуратно отделите клетки скребком. Затем соберите клетки и отфильтруйте через клеточные сетчатые фильтры размером 40 микрон, чтобы избежать загрязнения фрагментами сердечной ткани. Гранулируйте клетки центрифугированием при 200-кратном перегрузке в течение пяти минут, начиная с изолированных неонатальных мышиных сердец.

Разрежьте каждое сердечко на четыре части, которые все еще слабо соединены. Перенесите сердца в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую восемь миллилитров теплого 0,05% трипзина ЭДТА, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. После инкубации выбросьте трипсин ЭДТА и добавьте пять миллилитров теплого вихря коллагеназы второго типа на одну минуту со средней скоростью, а затем инкубируйте трубку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут.

Затем снова закрутите трубку в течение одной минуты. Дайте кусочкам ткани осесть и соберите надосадочную жидкость в новую пробирку, содержащую пять миллилитров холодной среды FB. Добавьте пять миллилитров свежей коллагеназы второго типа к кусочкам ткани и повторите этапы вихря и инкубации.

Соедините все клетки, содержащие надосадочную жидкость, отфильтровав их через сетчатый фильтр 40 мкм. Центрифугируйте эти элементы при температуре 200 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Следует обоим методам выделения сердечных фибробластов.

Промойте окончательную клеточную гранулу один раз в 10 миллилитрах магнитно-активированной сортировки клеток или максимальном буфере. Удалите 10 микролитров для подсчета живых клеток и центрифугируйте оставшиеся клетки при 200 умноженных на G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия менее чем на один умножить на 10 до седьмой клетки. Ресуспендируйте клеточную гранулу с 10 микролитрами бедра 1,2 сопряженных магнитных микрошариков в 90 микролитрах охлажденного максимального буфера и перемешайте.

Хорошо инкубируйте бусины при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут. Чтобы гранулировать клетки, добавьте 10 миллилитров максимального буфера и центрифугируйте образцы при 200-кратном G в течение пяти минут. Промойте один раз 10 миллилитров максимального буфера и повторно суспендируйте клеточную гранулу в общем объеме два миллилитра в колпаке для клеточных культур.

Настройте максимальный разделитель и добавьте столбец LS. Уравновесьте столбец тремя миллилитрами максимального буфера. Пропустите клеточную суспензию через колонку LS и трижды промойте двумя миллилитрами максимального буфера.

Затем извлеките колонку LS из сепаратора и трижды разбавьте двумя миллилитрами максимального буфера. Сбор ЭИТ в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте EIT при 200-кратном перегрузке в течение пяти минут.

Ресуспендируйте выделенные фибробласты в 10 миллилитрах среды FB и подсчитайте клетки, засейте клетки в чашки для культуры тканей в соответствующих плотностях в желатиновой 24-луночной пластине для перепрограммирования сердечных фибробластов. Добавьте 500 микролитров индуцированных кардиомиоцитов или среды ICM, содержащей полимозг, в каждую лунку из 24 луночных планшетов, где находятся клетки. Добавьте по 10 микролитров ретровируса в каждую лунку выделенных фибробластов.

Инкубируйте планшет с ретровирусными частицами в течение 24–48 часов в инкубаторе для клеточных культур. Затем замените вирусосодержащую среду 500 микролитрами свежей среды ICM, меняя среду каждые два-три дня. Начните положительный отбор вирусных трансдуцированных клеток, добавив в среду ICM два микрограмма на миллилитр пур-мицина.

После трех дней отбора измените среду на поддерживающую дозу в один микрограмм на миллилитр пур-мицина, чтобы визуализировать превращение сердечных фибробластов в кардиомиоциты. Наблюдайте за выбранными мицинами планшетами на экспрессию GFP с помощью инвертированного микроскопа. Наконец, через 14 дней после вирусного лечения замените среду ICM на B 27.

Средние локусы спонтанно бьющихся клеток могут появиться через три-четыре недели после вирусной трансдукции, экспрессии сердечных маркеров, включая сердечный тропонин Т и альфа. Актинин может быть обнаружен с помощью иммунохимии к 10-14 дням. Здесь экспрессия сердечного тропонина Т наблюдается в преобразованных из фибробластов I CMS, которые экспрессируют GFP альфа-актинин в ICM.

Анализ с помощью проточной цитометрии показывает аналогичное увеличение экспрессии сердечного тропонина Т, особенно после отбора индуцированных кардиомиоцитов с помощью мицина. Описанная здесь мифология позволяет эффективно генерировать индуцированные кардиомиоциты на основе ретровирусной доставки транскрипционных факторов NGT в одной конструкции.