Улучшена генерация индуцированной кардиомиоцитов Использование полицистронных Construct выражая оптимальное соотношение GATA4, MEF2C и Tbx5

Общая цель данного протокола — продемонстрировать способ эффективного получения индуцированных кардиомиоцитов из сердечных фибробластов с помощью полицистронной конструкции MGT, экспрессирующей оптимальное соотношение GATA4, TBX5 и MEF2C. Этот метод предоставляет ценную платформу для исследования индуцированных кардиомиоцитов и будет способствовать высокопроизводительному скринингу и изучению механизмов программирования индуцированных кардиомиоцитов, одновременно приближая данную область к клиническому применению. Основным преимуществом этой методики является то, что сердечные фибробласты могут быть эффективно преобразованы в кардиомиоциты с использованием всего одной ретровирусной конструкции.

Очистите новорожденную трансгенную мышь с GFP-маркированной альфа-тяжелой цепью миозина с помощью 75% (об./об.) этанола, после чего проведите эвтаназию. Затем вскройте брюшную полость, сделав горизонтальный разрез от одной подмышечной впадины до другой, используя стерильный тупой изогнутый пинцет.

Препарируйте сердце и поместите его в лунку 24-луночного планшета со льдом. В холодном PBS исследуйте экспрессию GFP во всем сердце с помощью флуоресцентной микроскопии. С помощью стерильного пинцета и ножниц перенесите от трех до четырех сердец с положительной экспрессией GFP в чашку Петри с центральной лункой диаметром 60 мм, затем измельчите сердца на мелкие фрагменты размером менее 1 мм³.

Перенесите измельченные сердца в чашку диаметром 10 см и залейте двумя миллилитрами среды fiberblast или среды FB. Оставьте планшеты в покое минимум на три часа в инкубаторе при температуре 37 °C. После инкубации медленно добавьте в чашку с измельченной тканью сердца восемь миллилитров предварительно подогретой среды FB.

Затем инкубируйте ткань в покое, за исключением замены среды каждые три дня. На седьмой день аспирируйте культуральную среду и промойте клетки DPBS. Добавьте в каждую лунку три миллилитра 0,05% trips в EDTA и инкубируйте при 37 °C в течение пяти минут.

Добавьте пять миллилитров среды FB для деактивации трипсина, затем осторожно отделите клетки с помощью скребка для клеток. Далее соберите клетки и профильтруйте их через клеточный стрейнер с размером пор 40 micron, чтобы избежать загрязнения фрагментами сердечной ткани. Осадите клетки центрифугированием при 200 ×g в течение пяти минут, начиная с изолированных сердец новорожденных мышей.

Разрежьте каждое сердце на четыре части, оставив их слабо соединенными. Перенесите сердца в коническую пробирку объемом 15 мл, содержащую 8 мл теплого 0,05% раствора трипсина-ЭДТА, и инкубируйте при 37 °C в течение 15 минут. После инкубации удалите трипсин-ЭДТА и добавьте 5 мл теплой коллагеназы типа II; перемешайте на вортексе в течение одной минуты на средней скорости, а затем инкубируйте пробирку на водяной бане при 37 °C от трех до пяти минут.

Затем снова перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение одной минуты. Дайте кусочкам ткани осесть и перенесите супернатант в новую пробирку, содержащую 5 mL холодного среды FB. Добавьте к кусочкам ткани 5 mL свежей коллагеназы типа 2 и повторите этапы перемешивания на вортексе и инкубации.

Объедините все супернатанты, содержащие клетки, профильтруя их через клеточный фильтр с размером пор 40 микрон. Центрифугируйте эти клетки при 200 ×g в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия. Далее следуйте любому из методов изоляции кардиальных фибробластов.

Промойте финальный клеточный осадок один раз в 10 milliliters магнитного буфера для сортировки клеток (MACS) или буфера max. Отберите 10 microliters для подсчета живых клеток, а оставшиеся клетки центрифугируйте при 200 ×g в течение пяти минут при температуре четыре degrees Celsius, если их количество составляет менее 1 × 10⁷ клеток. Ресуспендируйте клеточный осадок в 10 microliters конъюгированных магнитных микробусин thigh 1.2 в 90 microliters охлажденного буфера max и перемешайте.

Инкубируйте бусины при температуре 4 °C в течение 30 минут. Для осаждения клеток добавьте 10 мл Max Buffer и центрифугируйте образцы при 200 ×g в течение пяти минут. Один раз промойте 10 мл Max Buffer и ресуспендируйте осадок клеток в общем объеме 2 мл в ламинарном шкафу для культивирования клеток.

Подготовьте сепаратор Max и установите колонку LS. Уравновесьте колонку тремя миллилитрами буфера Max. Пропустите суспензию клеток через колонку LS и промойте её трижды двумя миллилитрами буфера Max.

Затем извлеките колонку LS из сепаратора и проведите элюцию трижды, используя по 2 мл max буфера. Соберите элюат (EIT) в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте элюат при 200 ×g в течение пяти минут.

Ресуспендируйте выделенные фибробласты в 10 миллилитрах среды FB и подсчитайте количество клеток, затем высейте клетки в чашки для культивирования тканей с соответствующей плотностью в 24-луночный планшет, предварительно покрытый желатином, для перепрограммирования кардиальных фибробластов. Добавьте по 500 микролитров среды для индуцированных кардиомиоцитов (ICM), содержащей poly brain, в каждую лунку 24-луночного планшета с высеянными клетками. Добавьте по 10 микролитров ретровируса в каждую лунку с выделенными фибробластами.

Инкубируйте планшет с ретровирусными частицами от 24 до 48 часов в инкубаторе для культур клеток. Затем замените среду, содержащую вирус, на 500 µL свежей среды ICM, меняя среду каждые два-три дня. Начните позитивную селекцию трансдуцированных вирусом клеток, добавив в среду ICM пуромицин в концентрации 2 µg/mL.

После трех дней селекции замените среду на поддерживающую дозу пуромицина 1 µg/mL для визуализации конверсии сердечных фибробластов в кардиомиоциты. Наблюдайте за экспрессией GFP на планшетах с селекцией пуромицином с помощью инвертированного микроскопа. Наконец, через 14 дней после вирусной обработки замените среду ICM на B 27.

Очаги спонтанного сокращения клеток в среде могут появиться через три-четыре недели после вирусной трансдукции при экспрессии сердечных маркеров, включая сердечный тропонин T и альфа-актинин. Последний может быть обнаружен методом иммунохимии на 10–14 день. Здесь видна экспрессия сердечного тропонина T в iCMS, конвертированных из фибробластов, которые экспрессируют GFP; экспрессия альфа-актинина в iCMS показана здесь.

Анализ методом проточной цитометрии показывает сходное повышение экспрессии сердечного тропонина T, особенно после селекции индуцированных кардиомиоцитов пуромицином. Описанная здесь методика позволяет эффективно получать индуцированные кардиомиоциты на основе ретровирусной доставки транскрипционных факторов NGT в составе одной конструкции.