Разработка коллоидного золота на основе Иммунохроматографические тест-полоски для обнаружения китообразных миоглобина

Общая цель этой иммунохроматографической полоски на основе коллоидного золота состоит в том, чтобы дифференцировать миоглобин китообразных от миоглобина тюленей и других животных. Этот метод может обеспечить быстрый и оперативный скрининг на предмет мяса китообразных, тем самым ограничивая его незаконную торговлю и потребление. Основное преимущество этой методики заключается в том, что успешный результат можно наблюдать уже через пять-десять минут после гомогенизации 03 грамма мышц, с выдающейся специфичностью и чувствительностью.

Так что этот метод может обеспечить быстрое обнаружение мяса китообразных в полевых условиях. Его также можно применять к другому мясу, такому как конина или свинина. Для создания синтетических пептидов для поднятия моноклональных антител с реакционной способностью к миоглобину китообразных проанализированы аминокислотные последовательности антигенных реактивных областей миоглобина у различных животных.

Начните с извлечения из GenBank аминокислотных последовательностей миоглобина у тунца, курицы, страуса, домашних млекопитающих, тюленей и 18 видов китообразных. Затем выровняйте последовательности с помощью соответствующего программного обеспечения. Запустите обозреватель выравнивания, выбрав команду «Выровнять редактировать/построить выравнивание» на панели запуска.

Выберите «Создать новое выравнивание» и нажмите кнопку «ОК». Появится диалоговое окно с вопросом, строите ли вы выравнивание последовательности ДНК или белка? Нажмите кнопку с надписью «Белок», выберите «Открытие данных, извлечение последовательностей из файла» и выберите «Файл последовательности». Выберите команду меню Изменить выбрать все, чтобы выбрать все сайты для каждой последовательности в наборе данных для создания множественного выравнивания последовательности.

Выберите Alignment Align by ClustalW в главном меню. Выберите BLOSUM в качестве матрицы массы белка и нажмите кнопку OK. Третий шаг — анализ выравнивания последовательности.

Сосредоточьтесь на пяти антигенных реактивных сайтах и найдите фрагмент, сохраняющийся у китообразных. Звездочка символизирует консенсус в выравнивании и указывает на позицию, которая имеет один, полностью сохранившийся остаток. У китообразных были обнаружены два сохранившихся фрагмента.

Затем фрагменты последовательности-кандидата синтезируют и используют для выращивания моноклональных антител. Начните эту процедуру с определения оптимального pH для раствора коллоидного золота, определяемого как минимальный pH, при котором смесь моноклонального антитела и раствора коллоидного золота остается красной в течение двух часов. Добавьте 0,15 мкг очищенного детектирующего моноклонального антитела к 100 микролитрам раствора коллоидного золота со значениями pH от пяти до девяти.

Для целей данной демонстрации были протестированы pH 6 и 8. pH 8 был признан оптимальным pH на этом этапе оптимизации. Далее определяют оптимальную концентрацию моноклонального антитела путем добавления различных количеств очищенного детектирующего моноклонального антитела к 100 микролитрам раствора коллоидного золота при рН 8.

Оптимальная концентрация, которая составляет шесть микрограммов на миллилитр в данном исследовании, позволит сохранить цвет смеси красным без черного осадка. Основываясь на результатах этапов оптимизации, добавьте 60 мкг очищенного детектирующего моноклонального антитела по каплям в 10 мл раствора коллоидного золота. Аккуратно эмульгируйте смесь при комнатной температуре в течение десяти минут.

Добавьте в смесь два миллилитра 5%-ного раствора BSA в PBS и аккуратно эмульгируйте при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы уменьшить фоновые помехи. Центрифугируйте смесь при 10 000 раз г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования осторожно удалить надосадочную жидкость с неконъюгированным антителом и суспензировать полученную гранулу в 4 мл PBS-T, содержащей 1% БСА и 0,1% Tween-20.

Повторите центрифугирование и суспензию один или два раза. Суспензируйте окончательные осадки в 1 мл PBS-T и храните при температуре четыре градуса Цельсия до использования. График дизайна иммунной полоски показан здесь.

Размеры картона, прокладок и нитроцеллюлозной мембраны указаны в тексте протокола. Чтобы продлить срок хранения, иммунные полоски должны быть подготовлены и собраны в условиях низкой влажности лабораторной среды. С помощью микропипетки добавьте раствор коллоидного моноклонального антитела, меченный золотом, в конъюгированную прокладку, чтобы пропитать ее, а затем высушите прокладку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа перед сборкой.

Как только конъюгатная прокладка высохнет, используйте двусторонний скотч, чтобы сначала наклеить нитроцеллюлозную мембрану на картон. С помощью иммунострип-принтера распределить специфическое антигензахватывающее моноклональное антитело и экспресс-антимышиный IGG на тестовой зоне и контрольной зоне, соответственно, на нитроцеллюлозной мембране. Соблюдайте расстояние между двумя зонами более пяти миллиметров.

Затем наклейте сопряженную прокладку с одной стороны нитроцеллюлозной мембраны, а абсорбирующую прокладку с другой стороны, перекрывая прокладки с каждой стороны примерно на два миллиметра. Поместите прокладку для образца на сопряженную прокладку на два миллиметра и наклейте ее на картон. С помощью резака для бумаги создайте полоски шириной шесть миллиметров.

Упакуйте полоски в пакет из алюминиевой фольги с влагопоглотителем и храните при температуре четыре градуса Цельсия до использования. Чтобы подготовить образец для теста на перекрестную реактивность, добавьте 1 мл PBS, содержащего 0,1% BSA, к 0,03 грамма сырой мышечной массы. А для гомогенизации образца используйте бамбуковую палку или шлифовальный стержень.

Держите иммунную полоску за конец, противоположный тестовой области, и опустите часть прокладки для образца в образец на пять-десять минут. Наблюдайте за результатом непосредственно. Тестируйте различные образцы мышц в трех экземплярах.

Тестовая линия T предназначена для отображения положительного сигнала, когда оба моноклональных антитела обнаруживают миоглобин китообразных. Поскольку миоглобин от животных, не являющихся китообразными, может быть обнаружен только одним из этих двух моноклональных антител, тестовая линия показывает отрицательный результат при тестировании образцов мышц от других животных. Контрольная линия C всегда должна показывать положительный результат, потому что быстрый антимышиный IGG связывается с коллоидным антителом для обнаружения, меченным золотом.

Неудачный результат в контрольной строке указывает на низкое качество материалов на полосе. Западный анализ крови с использованием супернатантов гибридомы показывает, что моноклональное антитело CGF5H9 обнаруживает китообразных и других млекопитающих в виде одной окрашенной полосы с прогнозируемой молекулярной массой около 17 кДа. Обыкновенный малый полосатик имеет сравнительно более слабую полосу, чем полосы других китообразных.

Полосы отсутствуют для тунца, тюленя, курицы. В то время как полоса около 50 кДа наблюдается у свиней. Идентичные результаты получают при точечном анализе крови.

Несмотря на то, что западный анализ крови с использованием моноклонального антитела CSF1H13 показывает множественные неспецифические полосы для свиньи и тунца, CSF1H13 является высокоспецифичным, поскольку реагирует только с китообразными. И у тюленя есть полоса с прогнозируемой молекулярной массой примерно 17 кДа. Идентичные результаты получают при точечном анализе крови.

Результаты непрямого иммуноферментного анализа мышечных экстрактов различных видов с использованием очищенного CGF5H9 демонстрируют положительные сигналы для коров, коз, собак, кроликов и китообразных, слабый положительный сигнал для свиней и отрицательные сигналы для тунца, курицы и тюленя. CSF1H13 проявляет высокую симпатию к китообразным и тюленям. Оба моноклональных антитела могут сильно реагировать со всеми четырьмя видами китообразных, принадлежащими к разным семействам, что указывает на их широкую реакцию на различные виды китообразных.

Специфичность иммунной коллоидной золотой полоски проявляется в этих репрезентативных результатах. Использование образцов мышц, не относящихся к китообразным, приводит к образованию только одной полосы на контрольной линии. Однако, когда используются образцы мышц китообразных, сигнальные полосы присутствуют как на тестовой линии, так и на контрольной линии.

После освоения получение меченых антител и эта конструкция полосок может быть выполнена за четыре часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о тщательном проектировании пептида. Используйте несколько методов для скрининга подходящих моноклональных антител.

И использовать высокое качество коллоидного золота для приготовления меченых антител. После этих процедур могут быть выполнены другие методы, такие как анализ ДНК на основе ПЦР, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как вид китообразных и откуда они произошли. Моноклональное антитело CSF1H13, которое является сильным и проявляет сродство только к морским млекопитающим, может быть использовано в различных форматах ИФА, которые предлагают множество других возможностей для изучения биологических, физиологических и химических аспектов миоглобина у морских млекопитающих.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как вырабатывать специфические моноклональные антитела и впоследствии наносить их на быструю тест-полоску.