Разработка коллоидного золота на основе Иммунохроматографические тест-полоски для обнаружения китообразных миоглобина

Общая цель данного иммунохроматографического теста на основе коллоидного золота заключается в дифференциации миоглобина китообразных от миоглобина тюленей и других животных. Этот метод позволяет проводить быстрый экспресс-скрининг мяса китообразных непосредственно на месте, что способствует пресечению его незаконной торговли и потребления. Главным преимуществом данной методики является то, что положительный результат можно наблюдать уже через пять-десять минут после гомогенизации 0.3 грамма мышечной ткани, при этом тест обладает исключительной специфичностью и чувствительностью.

Таким образом, данный метод позволяет осуществлять экспресс-определение мяса китообразных в полевых условиях. Он также может быть применен к другим видам мяса, например, к конине или свинине. Для разработки синтетических пептидов, необходимых для получения моноклональных антител, обладающих реактивностью к миоглобину китообразных, проводится анализ аминокислотных последовательностей антигенно-реактивных участков миоглобина различных животных.

Начните с получения из GenBank аминокислотных последовательностей миоглобина тунца, курицы, страуса, домашних млекопитающих, тюленя и 18 видов китообразных. Затем выровняйте последовательности с помощью соответствующего программного обеспечения. Запустите Alignment Explorer, выбрав Align Edit/Build Alignment на панели запуска.

Выберите Create New Alignment и нажмите OK. Появится диалоговое окно с вопросом о том, создаете ли вы выравнивание последовательностей ДНК или белков. Нажмите кнопку Protein, выберите Data Open Retrieve sequences from File и укажите файл с последовательностями. Выберите команду Edit Select All в меню, чтобы выделить все сайты для каждой последовательности в наборе данных для создания множественного выравнивания последовательностей.

В главном меню выберите Alignment, затем Align by ClustalW. В качестве весовой матрицы белков выберите BLOSUM и нажмите кнопку OK. Третьим шагом является анализ выравнивания последовательностей.

Сосредоточьтесь на пяти антигенно-реактивных сайтах и определите фрагмент, консервативный для всех китообразных. Звездочка в выравнивании символизирует консенсус и указывает на позицию с одним полностью консервативным остатком. Было обнаружено два консервативных фрагмента у китообразных.

Затем синтезируют фрагменты последовательностей-кандидатов и используют их для получения моноклональных антител. Начните эту процедуру с определения оптимального pH для раствора коллоидного золота, который определяется как минимальный pH, при котором смесь моноклональных антител и раствора коллоидного золота сохраняет красный цвет в течение двух часов. Добавьте 0.15 µg очищенных детектирующих моноклональных антител к 100 µL раствора коллоидного золота с различными значениями pH в диапазоне от пяти до девяти.

Для целей данной демонстрации тестируются pH 6 и pH 8. В результате данного этапа оптимизации pH 8 было определено как оптимальное значение. Далее определяют оптимальную концентрацию моноклонального антитела, добавляя различные количества очищенного детектирующего моноклонального антитела к 100 µL раствора коллоидного золота при pH 8.

Оптимальная концентрация, которая в данном исследовании составляет 6 µg/mL, позволяет сохранить красный цвет смеси без образования черного осадка. Основываясь на результатах этапов оптимизации, по каплям добавьте 60 µg очищенного детектирующего моноклонального антитела к 10 mL раствора коллоидного золота. Осторожно эмульгируйте смесь при комнатной температуре в течение десяти минут.

Добавьте к смеси два миллилитра 5% раствора BSA в PBS и аккуратно эмульгируйте при комнатной температуре в течение 15 минут для снижения фонового сигнала. Центрифугируйте смесь при 10,000 ×g в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После центрифугирования осторожно удалите супернатант с неконъюгированным антителом и ресуспендируйте полученный осадок в 4mL PBS-T, содержащего 1% BSA и 0.1% Tween-20.

Повторите центрифугирование и ресуспендирование один или два раза. Ресуспендируйте конечные осадки в 1mL PBS-T и храните при температуре четыре градуса Цельсия до использования. Здесь представлена схема конструкции иммунотест-полоски.

Размеры картона, подушечек и нитроцеллюлозной мембраны указаны в тексте протокола. Для продления срока хранения иммуно strips следует готовить и собирать в лабораторных условиях с низкой влажностью воздуха. С помощью микропипетки нанесите раствор моноклональных антител, меченных коллоидным золотом, на подушечку для конъюгата до ее полного насыщения, затем высушите подушечку при 37 °C в течение одного часа перед окончательной сборкой.

После высыхания конъюгационной подушечки с помощью двустороннего скотча прикрепите нитроцеллюлозную мембрану к картонному основанию. Используя принтер для иммунострипов, нанесите специфические моноклональные антитела для захвата антигена на тестовую зону и быстрые антимышиные IGG на контрольную зону нитроцеллюлозной мембраны. Соблюдайте расстояние между этими двумя зонами более 5 мм.

Затем приклейте конъюгатную подушечку с одной стороны нитроцеллюлозной мембраны, а абсорбирующую подушечку — с другой, обеспечив перекрытие мембраны подушечками примерно на два миллиметра с каждой стороны. Поместите подушечку для образца поверх конъюгатной подушечки с перекрытием в два миллиметра и приклейте ее к картонной подложке. С помощью резака для бумаги нарежьте полоски шириной шесть миллиметров.

Поместите полоски в пакет из алюминиевой фольги с десикантом и храните при температуре four degrees Celsius до использования. Для подготовки образца к тесту на перекрестную реактивность добавьте 1mL PBS, содержащего 0.1%BSA, к 0.03 grams сырой мышечной ткани. Затем с помощью бамбуковой палочки или стержня для растирания гомогенизируйте образец.

Держите иммунотест-полоску за конец, противоположный зоне тестирования, и погрузите часть с прокладочной подушечкой для образца в исследуемый материал на пять-десять минут. Считайте результат непосредственно по полоске. Протестируйте различные образцы мышц в трех повторностях.

Тест-линия T предназначена для отображения положительного сигнала, когда оба моноклональных антитела обнаруживают миоглобин китообразных. Поскольку миоглобин животных, не относящихся к китообразным, может быть обнаружен только одним из этих двух моноклональных антител, тест-линия показывает отрицательный результат при тестировании образцов мышц других животных. Контрольная линия C всегда должна показывать положительный результат, так как быстрые антимышиные IGG связываются с антителом для детекции, меченным коллоидным золотом.

Отсутствие результата в контрольной линии указывает на низкое качество материалов на тест-полоске. Вестерн-блот-анализ крови с использованием супернатантов гибридом не показал, что моноклональное антитело CGF5H9 детектирует китообразных и других млекопитающих в виде единой окрашенной полосы с расчетной молекулярной массой приблизительно 17kDa. У обыкновенного малого кита наблюдается сравнительно более слабая полоса, чем у других китообразных.

Полосы отсутствуют для тунца, тюленя и курицы. В то время как для свиньи наблюдается полоса около 50kDa. Аналогичные результаты получены при проведении дот-блот анализа крови.

Хотя вестерн-блот-анализ крови с использованием моноклонального антитела CSF1H13 дает множество неспецифических полос для свиньи и тунца, CSF1H13 обладает высокой специфичностью, так как реагирует только с китообразными. При этом у тюленя наблюдается полоса с расчетной молекулярной массой примерно 17kDa. Аналогичные результаты были получены при проведении дот-блот-анализа крови.

Результаты непрямого ИФА экстрактов мышц различных видов с использованием очищенных CGF5H9 демонстрируют положительные сигналы для коровы, козы, собаки, кролика и китообразных, слабый положительный сигнал для свиньи и отрицательные сигналы для тунца, курицы и тюленя. CSF1H13 проявляет высокое сродство к китообразным и тюленям. Оба моноклональных антитела могут сильно реагировать со всеми четырьмя видами китообразных из разных семейств, что указывает на их широкую реактивность к различным видам китообразных.

Специфичность иммунохроматографической тест-полоски с коллоидным золотом показана на этих репрезентативных результатах. Использование образцов мышц животных, не относящихся к китообразным, приводит к появлению только одной полосы на контрольной линии. Однако при использовании образцов мышц китообразных сигнальные полосы присутствуют как на тестовой, так и на контрольной линиях.

После освоения методики приготовление меченых антител и создание полосок может занять четыре часа при условии правильного выполнения всех этапов. При осуществлении данной процедуры важно тщательно продумать дизайн пептида. Для скрининга подходящих моноклональных антител следует использовать несколько методов.

И используйте высококачественное коллоидное золото для подготовки меченых антител. После выполнения этих процедур можно провести другие методы, такие как анализ ДНК на основе ПЦР, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о виде китообразного и его происхождении. Моноклональное антитело CSF1H13, которое обладает высокой силой сигнала и сродством только к морским млекопитающим, может быть использовано в различных форматах ИФА, что открывает множество других возможностей для изучения биологических, физиологических и химических аспектов миоглобина у морских млекопитающих.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как разрабатывать специфические моноклональные антитела и впоследствии использовать их в экспресс-тест-полосках.