Air дискретизацией анализ Фильтр для эндотоксинов и содержание ДНК

Общая цель данной процедуры — описать способ точного анализа содержания эндотоксина и ДНК в экстрактах частиц из воздуха, собранных на фильтрах. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований биоаэрозолей внутри помещений и на открытом воздухе, например, для понимания причин воздействия на здоровье. Процедуру отбора проб на фильтр продемонстрирует Инон Мазар, аспирант моей лаборатории.

Для отбора проб большого объема используйте фильтры из кварцевого волокна. Также можно выбрать конкретный тип фильтра и размер поровых отверстий, которые наилучшим образом соответствуют целям исследования. Предварительно прокалите фильтры, предназначенные для отбора проб органических и биологических соединений, предварительно обернув каждый из них в алюминиевую фольгу.

Затем их обжигают в лабораторной печи при 450 °C в течение не менее пяти часов. Это позволит уничтожить любые имеющиеся органические остатки. Обжженные фильтры хранят при 20 °C до начала их использования для отбора проб.

Затем очистите и продезинфицируйте пробоотборник большого объема, такой как описанный в прилагаемом текстовом протоколе. После этого поместите предварительно прокаленный фильтр в кассету для фильтров и запустите пробоотборник в соответствии с инструкциями производителя для сбора подходящего образца. В боксе биологической безопасности второго класса вырежьте 22 круглых фрагмента чистого предварительно прокаленного фильтровального материала, используя чистый пробкоотборник диаметром 1,12 см.

Используйте эти фрагменты для подготовки серии фильтров с добавлением эндотоксина, которые будут служить в качестве контролей. Затем вырежьте из фильтров с собранным образцом фрагменты с помощью чистого пробника диаметром 1,12 см и поместите каждый образец в отдельную пироген-свободную пробирку объемом 2 мл. Также перенесите высушенные фильтры с добавлением эндотоксина в отдельные пироген-свободные пробирки объемом 2 мл.

Добавьте по одному миллилитру пирогенно очищенной воды в каждую пробирку. Перемешивайте их в течение 60 минут при комнатной температуре на лабораторном шейкере. Затем центрифугируйте пробирки с образцами в микроцентрифуге при 375 ×g в течение 10 минут.

Затем перенесите супернатант, содержащий эндотоксины, в новую стерильную (пироген-свободную) пробирку объемом 2 мл. Подготовьте стерильный 96-луночный микропланшет с плоским дном и крышкой для проведения теста на эндотоксины, предварительно определив расположение образцов.

Затем включите планшетный ридер и запрограммируйте его для проведения кинетического анализа при 37 °C с перемешиванием каждые пять минут. Затем проведите измерения на длине волны 405 нм. Повторите цикл перемешивания в течение пяти минут и считывания планшета 18 раз.

Загрузите образцы в планшет, внеся по 50 µL стандартных растворов эндотоксина, которые ранее использовались для обогащения фильтров, в лунки с A1 по A10 и с B1 по B10. Внесите холостые пробы в лунки A11, A12, B11 и B12. Затем добавьте супернатант из центрифугированного экстракта обогащенного фильтра и соответствующие холостые пробы в ряды C и D. После этого добавьте супернатанты экспериментальных образцов и холостые пробы в остальные лунки по мере необходимости.

Для активации теста быстро добавьте по 50 µL раствора лимулус-амебоцитного гликолета в каждую лунку. Осторожно встряхните планшет в горизонтальном направлении. После этого поместите его в планшетный ридер и запустите эксперимент.

По завершении извлеките планшет из планшетного ридера. Определите уровень эндотоксинов в каждом образце, используя стандартную кривую, а также рассчитайте эффективность экстракции эндотоксинов из фильтров образцов. Сначала подготовьте фильтры с добавлением ДНК, как описано в сопровождающем текстовом протоколе.

Для каждого образца фильтра подготовьте смесь стеклянных шариков, промытых кислотой, в стерильных пробирках объемом 0.5 мл: 0.1 г шариков диаметром от 425 до 600 мкм и 0.3 г шариков диаметром не более 106 мкм. Затем с помощью дезинфицированного пробоотборника диаметром 1.12 см вырежьте три круглых фрагмента из случайно выбранных участков каждого образца фильтра. Поместите фрагменты фильтров в отдельные пробирки с завинчивающимися крышками объемом два мл.

Затем добавьте смесь стеклянных шариков в каждую пробирку вместе с 60 µL буфера для лизиса клеток, входящего в состав набора для экстракции ДНК. Закройте пробирки и поместите образцы в гомогенизатор с шариками. Используя гомогенизатор, подвергните отфильтрованные клетки механическому разрушению в течение одной минуты, после чего охладите образцы, поместив их на лед еще на одну минуту.

Повторите этот цикл пять раз. Далее следуйте протоколу поставщика набора и экстрагируйте ДНК из лизированных клеток. После элюции повторно пропустите элюированный образец через экстракционную колонку, чтобы увеличить выход ДНК.

Заблаговременно включите прибор для количественной ПЦР, чтобы дать ему прогреться. В новом файле программы в операционном программном обеспечении прибора введите параметры запуска количественной ПЦР. Затем продезинфицируйте рабочую поверхность средством для деконтаминации ДНК и используйте только стерильные пробирки, наконечники и реагенты.

Также поставьте рядом с рабочим столом ведро со льдом и поместите в него смесь tac polemoraris. Подготовьте реакционную смесь для количественной ПЦР согласно описанию в таблице 4 прилагаемого текстового протокола. Храните реакционную смесь в темном месте на льду до начала использования.

Затем поместите чистую микропланшету в держатель для планшетов, чтобы она не касалась рабочей поверхности и оставалась чистой. Добавьте один микролитр стандартной ДНК, ДНК образца или воды, свободной от нуклеаз, в лунки микропланшеты для количественной ПЦР в трех повторностях. Затем добавьте девять микролитров мастер-микса для реакции в каждую реакционную лунку.

По завершении накройте планшет оптической адгезивной пленкой и плотно загерметизируйте ее со всех сторон. Центрифугируйте планшет в центрифуге с соответствующими адаптерами в течение одной минуты при 1000 ×g перед помещением в амплификатор. В завершение запустите подготовленную программу количественной ПЦР.

В процессе экстракции эндотоксина образцы на фильтрах центрифугируют для извлечения эндотоксина из фильтра. Различные скорости центрифугирования приводят к разной эффективности экстракции, особенно при высоких концентрациях эндотоксина.

Для выбранного фильтра и выполненного протокола следует провести предварительное испытание эффективности экстракции. Более высокая эффективность экстракции достигается при добавлении стандарта в чистые фильтры по сравнению с пробоотборными кварцевыми фильтрами, при этом оба этих показателя ниже эффективности, достигаемой при прямом определении стандартного раствора. После освоения методики анализ на эндотоксины может быть выполнен за три с половиной часа при условии правильного проведения процедуры.

После выполнения данной процедуры можно использовать другие методы, такие как секвенирование ДНК, чтобы ответить на дополнительные вопросы о переносе организмов в атмосфере. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как эффективно экстрагировать эндотоксины и ДНК из фильтров проб воздуха и проводить их точный анализ.