Визуализация субклеточных структур в эмбрионе данио Living
2 апреля 2016 г.
Визуализация динамического поведения органелл и других субклеточных структур in vivo может пролить свет на их функцию в физиологических и патологических условиях. В данной работе мы представляем методы генетической маркировки двух органелл, центросом и митохондрий, а также визуализации их динамики в живых эмбрионах рыбок данио-рерио с помощью широкоугольной и конфокальной микроскопии.
Общая цель этого метода визуализации заключается в изучении субклеточных органелл у позвоночных in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии нейронных клеток, такие как динамика митохондрий или центросом в контексте in-vivo. Основное преимущество этой методики заключается в том, что весь эксперимент может быть проведен на интактном позвоночном, без необходимости проведения какой-либо хирургической процедуры.
Этот метод может дать представление не только о субклеточной динамике в физиологических условиях, но и может быть применен к исследованиям диссертационных моделей, таких как болезнь Альцгеймера. После создания транзиторно экспрессирующихся эмбрионов с помощью микроинъекций или получения эмбрионов из стабильных трансгенных линий, в соответствии с текстовым протоколом, в конце первого дня проводится скрининг на мертвые или неоплодотворенные яйцеклетки. Используя пластиковую пипетку для переноса, перенесите жизнеспособные эмбрионы в раствор Danieau, содержащий 1x PTU для предотвращения образования пигмента, и поддерживайте эмбрионы в растворе Danieau, содержащем 1x PTU, до скрининга на экспрессию трансгенов.
В день проведения эксперимента с визуализацией используйте флуоресцентный препарирующий микроскоп для скрининга обезболенных эмбрионов на экспрессию трансгенов. Затем перенесите выбранные эмбрионы в отдельную чашку Петри, содержащую буфер Данио с 1x PTU и 1x трикаином. После того, как эмбрионы будут обезболены, аккуратно введите несколько капельниц в низкоплавкую агарозу, содержащую 1x PTU и 1x трикаин, пропуская как можно меньше жидкости, чтобы избежать разбавления агарозы.
Переложите зародыши с небольшим количеством агарозы в чашку Петри со стеклянным дном. Затем, работая относительно быстро, используйте щипцы для позиционирования эмбрионов в нужной ориентации в зависимости от структуры, которую необходимо визуализировать. Эмбрионы должны быть правильно ориентированы, например, плоскими сбоку для визуализации сетчатки или нейрона Рохона-Бирда.
Точная ориентация обеспечит наилучшее качество изображения и оптимизирует скорость приобретения. Дав агарозе застыть в течение не менее 15 минут, добавьте буфер Данио с 1x PTU и 1x трикаином, чтобы покрыть эмбрионы. Для проведения широкопольной микроскопии, уравновесив чашку с установленными рыбами в нагревательной камере при температуре 28,5 градусов Цельсия, на предметном столике широкопольного микроскопа и выбрав интересующую область, откройте программное обеспечение микроскопа.
В разделе Illumination (Освещение) нажмите на Configuration settings (Настройки конфигурации), чтобы определить правильные наборы фильтров для интересующей длины волны. В разделе Настройки камеры введите время экспозиции, необходимое для получения подходящего изображения. Затем выберите конусный объектив для погружения в воду на большом расстоянии с 40-кратным до 100-кратным увеличением, который имеет самую высокую числовую апертуру и хроматическую коррекцию.
Нажмите «В реальном времени», чтобы выбрать поле зрения. В случае R-B нейрона изобразите митохондриальный транспорт в аксоне ствола, исходящий из тела клетки или в периферической оболочке. Затем в меню ImageJ нажмите на прямоугольную кнопку выбора и определите область интереса, или ROI.
И нажмите на ROI в окне микроменеджера. После выбора ROI для визуализации нажмите Stop and Save (Стоп и Сохранить), чтобы записать морфологию нейронов в канале YFP. Чтобы получить изображение митохондриального транспорта, нажмите на Multi-D Acquisition.
Затем в окне под названием «Многомерная съемка» выберите количество временных точек и интервал между временными точками. В окне «Многомерное сканирование» нажмите «Каналы», а затем добавьте и определите длину волны для визуализации и время воздействия. Нажмите «Сохранить изображения», чтобы автоматически сохранить файлы в определенной папке, указанной в маршруте каталога.
Теперь нажмите «Получить» в правом верхнем углу, чтобы начать создание изображений с замедленной съемкой. Для конфокальной микроскопии, поместив смонтированные эмбрионы в нагревательную камеру при температуре 28,5 градусов Цельсия на конфокальной сцене, откройте программное обеспечение микроскопа и нажмите на Trans Lamp или Epi Lamp. Затем с помощью окуляра микроскопа используйте либо проходящий, либо флуоресцентный свет соответственно, чтобы определить интересующую область.
В окне Настройка съемки убедитесь, что цель, выбранная для визуализации, совпадает с целью, отображаемой в раскрывающемся меню доступных целей. Затем в окне «Управление получением изображений» нажмите на кнопку со списком красителей и выберите подходящие флуорофоры. Либо нажмите на кнопку «Световой путь и красители», чтобы вручную задать параметры.
В окне «Настройка захвата» настройте коэффициент масштабирования и соотношение сторон размера отсканированного изображения, чтобы получить размер в пикселях, необходимый для наилучшего разрешения визуализируемых структур. Установите размер пикселя равным примерно половине теоретического разрешения объектива, тем самым следуя критериям выборки Найквиста. Чтобы определить размер изображения в пикселях, в окне «Управление получением изображений» нажмите кнопку «I».
Затем установите скорость сканирования на максимально возможную. Затем в окне «Управление получением изображений» нажмите на усреднение линии Калмана и установите коэффициент два или три, чтобы уменьшить шум. Чтобы выбрать режим последовательного сканирования для визуализации флуорофоров с перекрывающимися спектрами, нажмите на кнопку Последовательность и линия.
Затем отрегулируйте выходную мощность соответствующих лазерных линий. Чтобы непрерывно сканировать выбранную область при настройке параметров детектора для каждого канала, нажмите на кнопку «Повтор по оси XY» или «Фокус x2» или «Фокус x4». Затем отрегулируйте HV, усиление и смещение для каждого канала, чтобы получить изображения с самым высоким динамическим диапазоном значений серого.
Теперь нажмите Control плюс H, чтобы визуализировать полученные изображения с помощью таблицы поиска, которая определяет недонасыщенные пиксели синим цветом и перенасыщенные пиксели красным, которых следует избегать. Переоцените выходную мощность соответствующих лазерных линий и настройки детектора. Чтобы определить верхнюю и нижнюю границы объема, который должен быть изображен, в настройках захвата нажмите кнопку «Завершить набор» на верхнем пределе, а затем сфокусируйтесь на нижнем пределе и нажмите «Начать набор».
Чтобы проверить Z-разрешение объектива, в Управлении получением изображений нажмите на символ I. Затем выберите размер шага, равный половине разрешения Z для данной цели. В подокне TimeScan введите частоту, с которой должны быть получены Z-стеки, и количество раз, когда должны быть получены изображения, чтобы настроить временной ряд, соответствующий динамике субклеточной структуры, которую необходимо изобразить.
Нажмите на кнопки «Глубина» и «Время», чтобы подтвердить, что Z-стек и временные ряды будут получены. Наконец, нажмите на кнопку XY Zt, чтобы начать получение покадровых изображений. После получения изображения в интерфейсе программного обеспечения нажмите «Серия готово».
И сохраните изображения в формате OIB, чтобы записать изображения и связанные с ними метаданные. На этом рисунке показаны органеллы и R-B нейроны, расположенные на поверхности эмбриона, с помощью широких полей и конфокальной микроскопии. Здесь была использована покадровая визуализация на широкоугольном микроскопе для отслеживания движения отдельного митохондрия в периферической оболочке R-B нейрона.
Конфокальная визуализация происходит значительно медленнее и может привести к недооценке динамики конкретных субклеточных событий. Изображения клеток сетчатки, полученные с помощью широкопольной микроскопии, страдают от плохого контраста, так как флуоресцентные сигналы от большого объема ткани затемняют детали в фокальной плоскости. В этом случае возможность оптического среза конфокальной микроскопии заметно улучшает контраст.
На вставках показаны детали области внутреннего ядерного слоя с маркировкой клеточных мембран и митохондрий. Управляемая специфическим драйвером Gau-4 сенсорного нейрона, мозаичная экспрессия от инъекций UAS-mito-CFP и UAS MAY-FP позволяет отслеживать отдельные клетки в течение нескольких дней, как это видно на этом R-B сенсорном нейроне через два и три дня после оплодотворения. В дополнение к митохондриям, другие субклеточные органеллы, такие как центросомы, могут быть флуоресцентно помечены.
В этом примере две кассеты UAS на одной смежной конструкции управляли экспрессией YFP, нацеленного на центросомы, и церулана, нацеленного на мембрану, в клетках сетчатки. На врезках показана ячейка в фазе М. Вся эта процедура занимает несколько дней от спаривания, сбора яйцеклеток, инъекций и, наконец, визуализации через три или четыре дня после оплодотворения.
Фактический эксперимент с визуализацией на микроскопе может занять от нескольких минут до целого дня. После этой процедуры другие органеллы, такие как микротрубочки или пероксисомы, могут быть помечены и визуализированы, чтобы понять их динамику in vivo. Не забывайте, что ПТУ является канцерогеном, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод визуализации субклеточных органелл, в частности центросом и митохондрий, в живых эмбрионах данио-рерио. Этот метод позволяет исследователям изучать динамику органелл in vivo, что дает представление о физиологических состояниях и патологиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Методы визуализации
Теоретические основы
- Понимание динамики органелл имеет решающее значение для изучения клеточных функций.
- Изучение этой динамики in vivo дает преимущества по сравнению с традиционными методами.
- Эмбрионы данио-рерио служат моделью для исследований позвоночных.
- Данный метод может быть применен к различным моделям заболеваний, включая болезнь Альцгеймера.
Цель исследования
- Для исследования динамики митохондрий и centroсом в живых организмах.
- Для обеспечения неинвазивного метода изучения субклеточных структур.
- Для углубления понимания поведения органелл в физиологических условиях.
Используемые методы
- Генетическое мечение центросом и митохондрий.
- Широкопольная и конфокальная микроскопия для визуализации.
- Микроинъекции для получения эмбрионов с транзиторной экспрессией.
- Использование раствора Данио с PTU для поддержания жизнеспособности эмбрионов.
Основные результаты
- Успешная визуализация динамики органелл в живых эмбрионах zebrafish.
- Данные о поведении митохондрий и центросом in vivo.
- Потенциальные возможности применения при изучении моделей заболеваний.
- Демонстрация неинвазивного подхода к субклеточной визуализации.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для изучения динамики органелл.
- Он открывает новые возможности для исследований в области биологии нейронов и механизмов развития заболеваний.
- Эту методику можно адаптировать для различных экспериментальных условий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация субклеточных органелл в живых эмбрионах позвоночных позволяет напрямую наблюдать динамические клеточные процессы, важные для валидации мишеней и снижения механистических рисков на ранних этапах поиска лекарственных средств. Модель zebrafish предоставляет целостную, оптически доступную систему для изучения поведения органелл в физиологических условиях, что повышает прогностическую уверенность в модуляции сигнальных путей. Данный подход снижает зависимость от инвазивных моделей млекопитающих и ускоряет проверку гипотез в биологии нейронов и системах, релевантных для изучения заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем визуализации динамики митохондрий и centroсом in vivo.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней посредством прямого наблюдения за поведением органелл в нейрональном контексте.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность выбора мишени, связывая субклеточную динамику с клеточными фенотипами в системе позвоночных.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные визуализируемые субклеточные показатели для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимую подготовку меченых эмбрионов для согласованного рабочего процесса визуализации.
- Масштабируемость: Способствует повторному использованию платформы для различных целевых органелл с помощью общей генетической инфраструктуры и средств визуализации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между визуализацией органелл на этапе фундаментальных исследований и доклинической валидацией на моделях заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.
- Механистическое снижение рисков: позволяет уточнить вклад субклеточных структур в развитие клеточной дисфункции, связанной с заболеванием.
- Обоснованное продвижение с учетом рисков: предоставляет данные для принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), выявляя динамические ответы органелл на генетические или фармакологические воздействия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего этапа поиска путем предоставления данных с субклеточным разрешением, которые используются на стадиях валидации мишеней и идентификации ведущих соединений, особенно в программах, ориентированных на нейробиологию.
- Открывательная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей посредством прямой визуализации динамики органелл в живых нейронах.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные эмбриональные системы с флуоресцентно мечеными органеллами, готовые к проведению анализа для скрининга соединений.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение транспорта митохондрий и позиционирования центросом в качестве функциональных показателей.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность доклинических исследований путем моделирования субклеточной динамики в системах позвоночных, релевантных для изучения заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу для визуализации, адаптируемую к различным органеллам и типам клеток с помощью системы Gal4-UAS.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности субклеточных функций.
- Операционная ценность: Стандартизирует протоколы подготовки эмбрионов и визуализации для воспроизводимой оценки субклеточной динамики.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, обеспечивая раннее снижение рисков при работе с мишенями с помощью неинвазивной визуализации позвоночных.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков путем установления связи между поведением органелл и фенотипическими исходами в контексте заболеваний.
Особенности реализации
- Требуются навыки содержания zebrafish, микроинъекций и создания трансгенных линий.
- Необходимы системы флуоресцентной микроскопии с подходящими объективами и камерами контроля окружающей среды.
- Требуется стандартизация процедур определения стадии развития эмбрионов, анестезии и монтирования между исследовательскими группами.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных субклеточных мишеней и специфичных для типов клеток промоторов.
- Существуют практические ограничения, такие как фототоксичность и влияние пигментации, которые минимизируются использованием PTU и методами визуализации при низком освещении.
