Компьютерная томография и оптическая томография остеогенеза ангиогенеза муфта для оценки интеграция кости черепа аутотрансплантатов и аллотрансплантатов

Общей целью этой процедуры является мониторинг интеграции костных трансплантатов черепа с точки зрения регенерации кости и неоваскуляризации с использованием мультимодальных подходов к визуализации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной медицины, такие как связь остеогенеза и ангиогенеза. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает 3D-определение трех сосудов в высоком разрешении, а также позволяет изучить весь орган, демонстрируя процедуру Дорона Вика, аспиранта в моей лаборатории После усыпления семи-восьминедельной морской мыши Bab.

Согласно текстовому протоколу, используйте машинку для стрижки волос, чтобы сбрить черепную область против направления роста волос. Нанесите на тушку 70%-ный изопропанол, голову продезинфицируйте. Затем с помощью скальпеля No 11 разрежьте кожу головы и удалите надкостницу с помощью зубной бормашины и зубца внутреннего диаметра 4,5 миллиметра.

Отделите круглый фрагмент черепной кости. Перенесите фрагмент кости в 100-миллиметровую пластиковую посуду, содержащую стерильный физиологический раствор. На этом этапе с помощью изогнутого пинцета наблюдайте за кровью и мягкими тканями, прикрепленными к костному фрагменту.

Держите по одному фрагменту кости за раз и тщательно протрите его аппликатором с ватным наконечником. Удаление любых тканей мозга, мягких тканей и крови. С помощью тонких ножниц аккуратно отрежьте все костные сколы, которые остаются прикрепленными к трансплантату, чтобы трансплантат имел идеальную округлую форму.

Опустите каждый трансплантат один раз в 15-миллилитровую пробирку, содержащую 70% этанол, и дважды в 15-миллилитровую пробирку, содержащую PBS, чтобы смыть этанол. Заморозьте аллотрансплантат в морозильной камере при температуре минус 80 градусов Цельсия в криопробирках не менее чем на одну неделю после заморозки. Убедитесь, что аллотрансплантат выглядит прозрачным, работая с трансгенными мышами-реципиентами, экспрессирующими люциферазу под контролем промотора остеокальцина.

После обезболивания семи-восьминедельной самки мыши с использованием инъекционных анестетиков и верифицирующего седативного эффекта. Используйте машинку для стрижки волос против направления роста волос, чтобы сбрить черепную область. Нанесите средство для депиляции, чтобы удалить остатки шерсти, и используйте сухую марлю, чтобы стереть его не дольше двух минут.

Затем используйте марлю, смоченную в физрастворе, чтобы протереть эту область. Продезинфицируйте кожу головы, нанеся подкожно 5% хлоргексидин. Вводите пять миллиграмм на килограмм карпрофена, разведенного в 200 микролитрах физраствора.

Наносите глазную мазь, чтобы предотвратить сухость, и постоянно держите животное на термопрокладке. Затем расположите животное под операционным биноклем. Далее с помощью тонких ножниц и пинцета сделайте пинцетом овальный надрез длиной в один сантиметр на коже кожи головы.

Возьмитесь за надкостницу и с помощью тонких ножниц отрежьте ее зубной бормашиной и сверлом внешнего диаметра пять миллиметров, чтобы уточнить дефект черепа на два миллиметра впереди лямбдоидного шва, чтобы избежать проникновения твердой мозговой оболочки. Просверлите три четверти пути в кость и с помощью шпателя отделите костный фрагмент. Одним из важнейших этапов протокола является устранение локализации дефекта.

Травмирование полового шва приведет к массивному кровотечению. Поэтому следует соблюдать осторожность, чтобы не нарушить основную твердость и верхнюю сагиттальную систему. Для имплантации аутотрансплантата.

Используйте 10 миллилитров стерильного физиологического раствора в 10-миллиметровой пластиковой пластине для промывания костного фрагмента. Удалите тромбы без удаления мягких тканей, чтобы имплантировать аллотрансплантат, заранее разморозьте и нормализуйте образец до комнатной температуры. Затем промойте фрагмент кости изогнутым пинцетом.

Поместите костный трансплантат в дефект так, чтобы он не касался краев дефекта. Затем с помощью фибринового геля приклейте трансплантат к косточке хозяина. Зашить кожу четырьмя нитями Викрил и нанести на хирургический разрез повидон-йод.

Отметьте мышиное ухо и введите 0,25 миллиграмм на килограмм антиседана. Обратить вспять обезболивающее действие меато. Осуществляйте послеоперационный уход согласно текстовому протоколу.

Приготовьте гепаринизированный физиологический раствор, взвесив 2000 единиц гепарина натрия и переложив в 50-миллилитровую пробирку. Добавьте в тюбик 20 миллилитров стерильного физиологического раствора и встряхните. Ну, наполните 20-миллилитровый шприц с приманкой 15 миллилитрами подогретого гепаринизированного физиологического раствора и подсоедините шприц к набору вен для кожи головы 23 калибра.

Прикрепите шприц к шприцевому насосу и установите насос на 10 миллилитров со скоростью один миллилитр в минуту. После обезболивания мыши в соответствии с текстовым протоколом подтвердите седацию щипцом на пальце ноги и закрепите мышь. Его спина к фиксирующей доске обернута абсорбирующим поверхностным вкладышем.

Далее разрежьте кожу от живота до шеи. Разрежьте брюшную стенку вплоть до мечевидного отростка. Затем разрежьте грудную клетку по боковой стороне, убедившись, что сердце полностью обнажено, а сердце и легкие не повреждены.

Используйте кровоостанавливающее средство для втягивания грудины. Введите иглу-бабочку на три миллиметра в левый желудочек. Затем с помощью трех секунд клея приклейте иглу к сердцу и грудной стенке Введение иглы-бабочки в левый желудочек является деликатной процедурой.

Старайтесь избегать введения в правый желудочек или слишком глубоко в левый желудочек, потому что он проникнет через заднюю стенку сердца. Далее сразу же активируйте насос. Через минуту рассеките нижнюю полую вену полой вены, чтобы сбросить давление в сосудистой сети.

Наклоните доску так, чтобы жидкость стекала от головы. Успешная перфузия приведет к очищению печени и кровеносных сосудов. Теперь перфузируется 10 миллилитров 4%-ного формальдегида.

Недопущение проникновения пузырьков воздуха в сосудистую систему. Когда перфузия завершится, что проявляется в жесткости хвоста, используйте 10 миллилитров гепаринизированного физиологического раствора для вымывания формальдегида. Приготовьте радиоконтрастное вещество в соответствии с инструкциями производителя.

Смешав составной разбавитель и отвердитель в пластиковой пробирке, перфузируйте животное контрастным веществом со скоростью один миллилитр в минуту. Коронарные, кишечные и печеночные артерии должны стать желтыми после завершения перфузии. Разрежьте трубку до иголки-бабочки и заверните тушку в бумагу, чтобы предотвратить попадание раствора в кварную область.

Поместите животное при температуре четыре градуса Цельсия на ночь, чтобы обеспечить полимеризацию на следующий день. Чтобы рассечь черепную область, используйте скальпель, чтобы разрезать кожу как можно более латерально, избегая повреждения интересующей области черепа. Найдите костный трансплантат, а затем с помощью тонких ножниц разрежьте черепную кость на расстоянии 10 миллиметров от трансплантата.

С помощью микрокомпьютерного томографа. Установите поле зрения на 20,5 миллиметров, рентгеновскую энергию на 55 KVP, интенсивность на 145 микроампер, тысячу проекций на 360 градусов и время интегрирования 200 миллисекунд. Отсканируйте изолированный образец канализационной кости.

Посмотрите на реконструированные в 2D срезы, созданные с помощью программного обеспечения микрокомпьютерной томографии. Убедитесь, что вы правильно отсканировали интересующую область, а затем найдите дефект черепа. Если перфузированные сосуды легко идентифицируются, используйте 6% трихлоруксусную кислоту, разведенную в воде двойной дистилляции.

Чтобы очистить образец от накипи, повторно отсканируйте его с использованием тех же параметров, которые только что были описаны. Найдите лямбдоидный шов в реконструированных 2D-срезах. Определите цилиндрический интересующий объем или VOI высотой два миллиметра и диаметром восемь миллиметров, который является тангенциальным к шву.

Это анатомический участок дефекта. Далее отделить кость от мягких тканей. Установите нижний порог на 130 и примените ограниченный 3D фильтр Гаусса для частичного подавления шума в громкости.

Создайте 3D-реконструкцию. Проверка правильности позиционирования VOI с помощью программного обеспечения IPL и объекта DT. Функция Peram генерирует карту толщины.

Эта функция описывает объем сосуда для каждого диаметра сосуда, проводит визуализацию и микрокомпьютерную томографию. Согласно текстовому протоколу, как показано здесь, через семь дней после операции компьютерная томография показала значительно больший объем кровеносных сосудов малого и среднего диаметра, которые питали всю область трансплантата у мышей, получивших автографы, в отличие от мышей, получавших аллотрансплантаты, в которых сосуды, казалось, проникали извне. Кроме того, флуоресцентная визуализация показала значительно более высокую перфузию крови у животных, получавших автограф.

К 14-му дню сосудистое дерево в аллотрансплантате достигает всех привязей к графтам. Тем не менее, объем судов был значительно ниже по сравнению с группой Autographt. Эта разница была наиболее заметной, когда сосуды диаметром от 0,08 до 0,1 мм сравнивались, как видно на рисунке через 28 дней после операции, объем сосудистой сети возвращался к исходному уровню через семь дней после операции.

Группа аутотрансплантатов продемонстрировала значительно большую минерализацию кости, что видно при флуоресцентной визуализации с использованием гидроксиапатитового направленного зонда. Кость сформировалась по всей близости трансплантата в этой группе, в то время как она сформировалась только на краях дефекта в группе аллотрансплантата, отмеченной формой кольца, через 56 дней после операции объем кости был значительно выше, а толщина трансплантата была значительно выше у животных, получавших автографы, по сравнению с аллотрансплантатами. После этой процедуры может быть выполнена флуоресцентная визуализация с использованием других зондов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, об активности остеокластов и участии иммунного ответа.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как визуализировать регенерацию кости в основном ангиогенезе.