Приготовление Thermoresponsive наноструктурированных поверхностей для тканевой инженерии

Общая цель этого метода Ленгмюра-Шефера с блок-сополимерами заключается в изготовлении клеточных листов в различных условиях чувствительной к температуре поверхности, контролируя прочность адгезии и прикрепления ячеек. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биоматериалов, такие как биосовместимые материалы, поверхность клеточных культур и биосепарация. Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно контролировать взаимодействие между чувствительной к температуре поверхностью и ячейками, а также оптимизировать условия модификации для восстановления клеточного листа.

Хотя этот метод может дать представление о взаимодействии между клеткой и поверхностью, он также может быть применен к другим системам, таким как биосепарация и биопленка. Для начала растворите стирол, ЭСТ и ACVA в 40 миллилитрах 1,4-Диоксана. Заморозьте раствор в жидком азоте под вакуумом на 15-20 минут, чтобы удалить реакционноспособные вещества.

После постепенного размораживания раствора при комнатной температуре повторите этот цикл замораживания, прокачки, размораживания, дегазации три раза. Получите полистирол в качестве агента macro-RAFT путем полимеризации при 70 градусах Цельсия в течение 15 часов в масляной ванне. Осадите полистирольный агент macro-RAFT с 800 миллилитрами эфира и высушите в вакууме.

Далее растворите мономер IPAAm, полистирольный агент macro-RAFT и ACVA в четырех миллилитрах 1,4-диоксана. Удалите кислород из раствора с помощью циклов замораживания, насоса, размораживания дегазации, как и раньше. Проведите полимеризацию при температуре 70 градусов Цельсия в течение 15 часов в масляной ванне после дегазации.

Наконец, получают синтезированную молекулу St-IPAAm таким же образом, как и полистирольный агент макро-RAFT. Вымойте стеклянные подложки с избытком ацетона и этанола и проведите ультразвуковую обработку в течение пяти минут, чтобы удалить поверхностные загрязнения. Подложку просушить в духовке при температуре 65 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Затем используйте кислородную плазму для активации поверхностей подложек при комнатной температуре. Погрузите субстраты в толуол, содержащий 1%-ный гексатриметоксисилан, на ночь при комнатной температуре, чтобы силанизировать субстрат. Затем промойте силанизированные основания в толуоле и погрузите в ацетон на 30 минут, чтобы удалить непрореагировавшие вещества.

Отжигите подложки в течение двух часов при температуре 110 градусов Цельсия для полной иммобилизации поверхности. Наконец, разрежьте силанизированные субстраты стеклорезом до размеров 25 на 24 миллиметра, чтобы они соответствовали чашкам для клеточных культур. Поместите инструмент для пленки Ленгмюр в шкаф, чтобы предотвратить накопление пыли.

Промойте корыто Ленгмюра в барьерах дистиллированной водой и этанолом, чтобы удалить загрязнения. Просушите корыто и шлагбаумы, протерев безворсовым полотенцем. Затем наполните кормушку примерно 110 миллилитрами дистиллированной воды, и установите преграды по обе стороны от кормушки.

Далее нагрейте платиновую пластину Вильгельми для контроля поверхностного натяжения, газовой горелкой до тех пор, пока пластина не станет красной. Затем вымойте тарелку дистиллированной водой, чтобы удалить загрязнения. Подвесьте пластину Вильгельмия на проволоку, прикрепленную к прибору для измерения поверхностного давления.

Обнулите прибор для измерения поверхностного давления в соответствии с протоколом производителя. Сожмите границу раздела воздуха и воды на желобе у барьеров с обеих сторон желоба до тех пор, пока граница раздела не достигнет примерно 50 квадратных сантиметров без каких-либо капель полимера. Отсасывайте любые мелкие загрязняющие вещества до тех пор, пока поверхностное давление не достигнет почти нуля миллиньютонов на метр.

Установите барьеры с обеих сторон и добавьте дистиллированную воду, чтобы компенсировать уменьшение дистиллированной воды. Затем растворите пять миллиграммов синетизированной молекулы St-IPAAm в пяти миллилитрах раствора хлороформа. Затем аккуратно капните 27 микролитров St-IPAAm, растворенного в хлороформе, на кормушку с помощью микрошприца или микропипетки.

Подождав пять минут, чтобы обеспечить полное испарение хлороформа, переместите оба барьера горизонтально, чтобы сжать молекулу St-IPAAm на поверхности. Поддерживайте степень сжатия барьеров на уровне 0,5 миллиметра в секунду до тех пор, пока не будет достигнута целевая площадь в 50 квадратных сантиметров. Измерьте изотермы поверхностного давления Pi-A с помощью платиновой пластины Вильгельми, прикрепленной к прибору для измерения поверхностного давления во время сжатия, согласно протоколу производителя.

После достижения целевого размера области сохраняйте поверхность в течение пяти минут, чтобы позволить молекулам St-IPAAm расслабиться. Молекулы не достигают равновесия сразу после сжатия. Затем перенесите пленку Ленгмюра на гидрофобно-модифицированную стеклянную подложку с помощью передаточного аппарата в течение пяти минут, чтобы прочно поглотить пленку.

Закрепите параллельно на приборе гидрофобную стеклянную подложку. Подключите устройство к юстировочной ступени и двигайтесь перпендикулярно. Поднимите основание горизонтально с помощью передаточного устройства и высушите в течение одного дня в эксикаторе.

Для приготовления клеточных суспензий культивируют эндотелиальные клетки сонной артерии крупного рогатого скота, или БАЭК, до 1/3 слияния при 37 градусах Цельсия в 5% СО2 и 95% воздуха, на культуре ткани полистирола с ДМЭМ, содержащим FBS и пенициллин. После достижения слияния обработайте BAEC тремя миллилитрами 0,25% трипсина ЭДТА в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия при 5% CO2 и 95% воздуха. Деактивируйте трипсин ЭДТА, добавив 10 миллилитров DMEM, содержащего 10% FBS.

И соберите клеточную суспензию в 50-миллилитровую коническую трубку. После центрифугирования при 120-кратном g в течение пяти минут аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах DMEM. Засейте восстановленные клетки на поверхности St-IPAAm в концентрации 10 000 клеток на квадратный сантиметр, подсчитанной одноразовым гемоцитометром.

Наблюдайте за клетками на поверхностях с помощью микроскопа, оснащенного инкубатором, при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2 и 95% воздуха. Далее простерилизуйте поверхности St-IPAAm ультрафиолетовым светом, оборудованным для чистой скамейки. Записывайте покадровые изображения адгезивных BAEC в течение примерно 24,5 часов при 37 градусах Цельсия с помощью фазово-контрастного микроскопа с 10-кратным увеличением.

После адгезии BAEC зарегистрируйте отделение BAEC от поверхности St-IPAAm при температуре 20 градусов Цельсия в течение примерно 3,5 часов. После оптимизации адгезии и отслоения клеток на поверхности, перенесенной пленкой Ленгмюра, изготовьте листы ячеек путем предварительного культивирования BAEC, как и раньше. Засейте в общей сложности 100 000 клеток на квадратный сантиметр на поверхности St-IPAAm.

И инкубируются в течение трех дней при 37 градусах Цельсия при 5% CO2. Сливающиеся BAEC спонтанно отделяются при 20 градусах Цельсия. Здесь показано приготовление термочувствительной поверхности, переносимой пленкой Ленгмюра.

Синтезированный раствор хлороформа St-IPAAm аккуратно капали на границу раздела воздух-вода. Два барьера были использованы для сжатия молекул St-IPAAm на границе раздела до достижения целевой площади в 50 квадратных сантиметров. Поверхностное давление измерялось во время сжатия для обнаружения любых дефектов в пленке Ленгмюра.

После сжатия гидрофобно модифицированная подложка из защитного стекла горизонтально размещалась на границе раздела с юстировочным столиком. Субстрат поднимали горизонтально и сушили в течение одного дня. После этого шага поверхности St-IPAAm были готовы к использованию в экспериментах по культивированию клеток.

Представлены репрезентативные результаты атомно-силовых микросографических топографических изображений поверхностей St-IPAAm. Наноструктуры наблюдались на обеих поверхностях St-IPAAm. Размер и форма наноструктур сильно зависели от аддитивного производства, а также от состава St-IPAAm.

Здесь показано макроскопическое изображение восстановленного клеточного листа на поверхности пленки Ленгмюра, перенесенной с помощью St-IPAAm 480, и AM 40 квадратных нанометров на молекулу. Клетки достигали слияния после трех дней в культивировании на поверхностях St-IPAAm 170 и St-IPAAm 480 при температуре 37 градусов Цельсия. А лист ячейки был быстро восстановлен после снижения температуры с 37 до 20 градусов по Цельсию.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как изготавливать, как проектировать молекулярный состав полимера, изготавливать и переносить пленку Ленгмюра, контролировать адгезию и отслоение клеток, а также восстанавливать клеточный лист. После своего развития этот метод открывает путь для исследователей в области биоматериалов и тканевой инженерии для изучения взаимодействий между клетками и поверхностями, а также стратегий культивирования клеток для использования в дегенеративной медицине. Применение этого метода распространяется и на терапию клеточной трансплантации, поскольку этот метод имеет потенциал для изготовления клеточных листов различных типов клеток, полученных от пациентов.