Приготовление Thermoresponsive наноструктурированных поверхностей для тканевой инженерии

Общая цель данного метода Ленгмюра-Шеффера с использованием блок-сополимеров заключается в создании клеточных пластов при различных условиях на термочувствительной поверхности путем контроля силы адгезии и прикрепления клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биоматериалов, такие как разработка биосовместимых материалов, оптимизация поверхностей для культивирования клеток и биосепарация. Основным преимуществом данной методики является возможность контроля взаимодействия между термочувствительной поверхностью и клетками, а также оптимизация условий модификации для восстановления клеточных пластов.

Хотя этот метод позволяет получить представление о взаимодействии между клеткой и поверхностью, его также можно применять к другим системам, таким как биосепарация и биопленки. Для начала растворите стирол, ECT и ACVA в 40 миллилитрах 1, 4-диоксана. Заморозьте раствор в жидком азоте под вакуумом в течение 15–20 минут для удаления реакционноспособных форм.

После постепенного размораживания раствора при комнатной температуре повторите цикл «замораживание — откачка — размораживание» (дегазация) трижды. Синтезируйте полистирольный макро-RAFT-агент путем полимеризации при 70 °C в течение 15 часов в масляной бане. Осадите полученный полистирольный макро-RAFT-агент в 800 мл эфира и высушите в вакууме.

Затем растворите мономер IPAAm, полистирольный макро-RAFT-агент и ACVA в четырех миллилитрах 1, 4-диоксана. Удалите кислород из раствора, используя циклы дегазации «замораживание-откачка-оттаивание», как описывалось ранее. После дегазации проведите полимеризацию при 70 °C в течение 15 часов в масляной бане.

Наконец, полученную синтезированную молекулу St-IPAAm выделите тем же способом, что и полистирольный макро-RAFT-агент. Промойте стеклянные подложки избытком ацетона и этанола, затем обработайте их ультразвуком в течение пяти минут для удаления загрязнений с поверхности. Высушите подложки в печи при 65 °C в течение 30 минут.

Затем используйте кислородную плазму для активации поверхностей подложек при комнатной температуре. Погрузите подложки в толуол, содержащий 1% гексатриметоксисилана, на ночь при комнатной температуре для силанизации подложки. После этого промойте силанизированные подложки толуолом и погрузите в ацетон на 30 минут для удаления непрореагировавших реагентов.

Проведите отжиг подложек в течение двух часов при 110 °C для полной иммобилизации поверхности. В завершение разрежьте силанизированные подложки стеклорезом до размеров 25 мм на 24 мм, чтобы они соответствовали размеру чашек для культивирования клеток. Поместите установку для создания пленок Ленгмюра в шкаф для предотвращения накопления пыли.

Промойте ванну Ленгмюра и барьеры дистиллированной водой и этанолом, чтобы удалить загрязнения. Протрите ванну и барьеры безворсовым полотенцем до полного высыхания. Затем наполните ванну примерно 110 миллилитрами дистиллированной воды и установите барьеры по обе стороны ванны.

Затем в горелке нагрейте платиновую пластину Вильгельми для мониторинга поверхностного натяжения до тех пор, пока она не раскалится докрасна. После этого промойте пластину дистиллированной водой для удаления загрязнений. Подвесьте пластину Вильгельми на проволоке, прикрепленной к прибору для измерения поверхностного давления.

Обнулите прибор для измерения поверхностного давления в соответствии с протоколом производителя. Сблизьте барьеры с обеих сторон кюветы, чтобы сжать границу раздела воздух-вода до площади примерно 50 квадратных сантиметров, убедившись в отсутствии капель полимера. Удалите все мелкие загрязнения путем аспирации, пока поверхностное давление не станет практически равным нулю миллиньютонов на метр.

Снова установите барьеры по обеим сторонам и добавьте дистиллированную воду, чтобы компенсировать ее убыль. Затем растворите 5 mg синтезированной молекулы St-IPAAm в 5 mL раствора хлороформа для проявления. После этого осторожно нанесите 27 µL растворенного в хлороформе St-IPAAm на поверхность лотка с помощью микрошприца или микропипетки.

После пятиминутного ожидания для полного испарения хлороформа переместите оба барьера по горизонтали, чтобы сжать молекулы St-IPAAm на поверхности. Поддерживайте скорость сжатия барьеров на уровне 0,5 millimeters per second до достижения целевой площади 50 square centimeters. В процессе сжатия измеряйте изотермы поверхностного давления Pi-A с помощью платиновой пластинки Вильгельми, присоединенной к прибору для измерения поверхностного давления, согласно протоколу производителя.

После достижения целевого размера области выдержите поверхность в течение пяти минут, чтобы молекулы St-IPAAm могли релаксировать. Молекулы не достигают равновесия сразу после сжатия. Затем в течение пяти минут перенесите пленку Ленгмюра на гидрофобно-модифицированную стеклянную подложку с помощью переносящего устройства для надежной адсорбции пленки.

Параллельно закрепите гидрофобную стеклянную подложку на устройстве. Подключите устройство к станку для юстировки и переместите перпендикулярно. Горизонтально поднимите подложку с помощью передаточного аппарата и высушите в течение одного дня в эксикаторе.

Для приготовления клеточных суспензий культивируйте эндотелиальные клетки сонной артерии быка (BAECs) до достижения 1/3 конфлюэнтности при 37 °C в атмосфере 5% CO2 и 95% воздуха на полистироле для культивирования тканей с использованием среды DMEM, содержащей FBS и пенициллин. После достижения необходимого уровня конфлюэнтности обработайте BAECs тремя миллилитрами 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в течение трех минут при 37 °C в атмосфере 5% CO2 и 95% воздуха. Инактивируйте трипсин-ЭДТА, добавив 10 миллилитров среды DMEM, содержащей 10% FBS.

Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл. После центрифугирования при 120 ×g в течение пяти минут аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клетки в 10 мл DMEM. Высейте полученные клетки на поверхности St-IPAAm с концентрацией 10 000 клеток на квадратный сантиметр, подсчитанной с помощью одноразового гемоцитометра.

Наблюдайте за клетками на поверхностях с помощью микроскопа, оснащенного инкубатором при 37 °C с 5%CO2 и 95% воздуха. Затем стерилизуйте поверхности St-IPAAm с помощью ультрафиолетового излучателя, установленного в ламинарном боксе. Записывайте изображения таймлапс-съемки адгезированных BAECs в течение приблизительно 24,5 часов при 37 °C с помощью фазово-контрастного микроскопа с 10-кратным увеличением.

После адгезии BAEC регистрируйте открепление BAEC от поверхности St-IPAAm при 20 °C в течение примерно 3,5 часов. После оптимизации адгезии и открепления клеток на поверхности с перенесенной пленкой Ленгмюра сформируйте клеточные пласты, предварительно культивируя BAEC, как описано выше. Высейте в общей сложности 100 000 клеток на квадратный сантиметр поверхности St-IPAAm.

Затем инкубируют в течение трех дней при 37 °C в атмосфере 5% CO2. Конфлюэнтные BAECs спонтанно отделяются при 20 °C. Здесь показано приготовление поверхности с перенесенной термочувствительной пленкой Ленгмюра.

Синтезированный раствор St-IPAAm в хлороформе осторожно наносили по каплям на границу раздела фаз воздух-вода. Для сжатия молекул St-IPAAm на интерфейсе использовали два барьера до достижения целевой площади 50 квадратных сантиметров. В процессе сжатия измеряли поверхностное давление для выявления возможных дефектов в пленке Ленгмюра.

После сжатия гидрофобно-модифицированная покровная стеклянная подложка была горизонтально помещена на границу раздела фаз с помощью позиционирующего устройства. Подложку подняли по горизонтали и сушили в течение одного дня. После этого этапа поверхности St-IPAAm были готовы к использованию в экспериментах по культивированию клеток.

Здесь представлены репрезентативные результаты топографических изображений поверхностей St-IPAAm, полученные с помощью атомно-силовой микроскопии. На обеих поверхностях St-IPAAm наблюдались наноструктуры. Размер и форма наноструктур в значительной степени зависели от AM и состава St-IPAAm.

Здесь представлено макроскопическое изображение извлеченного клеточного пласта с поверхности с перенесенной пленкой Ленгмюра с St-IPAAm 480 и AM 40 квадратных нанометров на молекулу. Клетки достигли конфлюэнтности через три дня культивирования на поверхностях St-IPAAm 170 и St-IPAAm 480 при 37 °C. Клеточный пласт был быстро извлечен после снижения температуры с 37 до 20 °C.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать полимеры с заданным молекулярным составом, формировать и переносить пленки Ленгмюра, контролировать адгезию и открепление клеток, а также восстанавливать клеточные пласты. После разработки эта методика открывает исследователям в области биоматериалов и тканевой инженерии путь к изучению взаимодействий между клетками и поверхностями, а также стратегий культивирования клеток для применения в регенеративной медицине. Значимость данного метода распространяется на терапию по трансплантации клеток, поскольку он обладает потенциалом для создания клеточных пластов из различных типов клеток, полученных от пациентов.