Быстрый воздушно-сухой Падение Хромосома Способ получения Подходит для рыбы у растений

Общая цель этого метода заключается в получении хромосом растений, пригодных для флуоресценции в технике гибридизации C two, с использованием зондов ДНК с одной и высокой копией. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы цитогенетики и исследования генома, такие как обнаружение хромосомных перестроек, упорядочивание генетических маркеров на хромосомах и сравнительный анализ между различными видами. Основное преимущество этой процедуры заключается в том, что подготовка хромосомных разбросов становится быстрой, простой и эффективной.

Клеточную суспензию можно хранить при температуре минус 20 градусов до двух месяцев и при необходимости использовать для подготовки хромосом. Впервые у нас появилась идея об этом методе, когда мы заметили, что качество и количество подходящих хромосом резко возросли за несколько человеческих дней. Проращивайте от 10 до 20 семян ячменя на двух слоях влажной фильтровальной бумаги в чашке Петри в течение двух дней при температуре от 22 до 24 градусов по Цельсию через два дня. Обрежьте сильнорослые корни длиной от одного до двух сантиметров от семени с помощью лезвия бритвы.

Затем приготовьте ледяную воду, поместив стеклянную бутылку объемом 500 миллилитров с холодной водопроводной водой в колотую ледяную воду. Проветривайте ледяную воду и погрузите кончики корней на 20 часов, чтобы увеличить частоту метафазных клеток. Перенесите корни из воды на 50 миллилитров этанола фиксатора уксусной кислоты, чтобы зафиксировать их при комнатной температуре в течение двух суток после фиксации.

Дважды промойте от 10 до 20 корней 30 миллилитрами ледяной водопроводной воды в стеклянном динамике объемом 50 миллилитров в течение пяти минут. Перенесите корни по одному в 30 миллилитров цитратного буфера с помощью щипцов. Промойте корни, дважды встряхнув стеклянный динамик в течение пяти минут.

Затем поместите корни на фильтровальную бумагу, чтобы полностью удалить жидкость под микроскопом. Отрежьте нежелательную немеристемную ткань с помощью лезвия бритвы. Наиболее важным этапом этой процедуры является определение правильного времени переваривания, которое может варьироваться у разных видов.

Здесь до 20 кончиков корней инкубируются в одном миллилитре ферментной смеси при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно 50 минут. Чтобы размягчить ткани растения в часовом стекле под микроскопом, удалите фермент с помощью пипетирования и промойте кончики корней на льду пятью миллилитрами 0,01 молярного цитратного буфера для замены остаточного фермента. Продолжайте тщательно промывать кончики корней одним миллилитром 96%-ного этанола дважды в том же стекле часов.

Затем замените этанол от 10 до 15 микролитров свежеприготовленного фиксатора на кончик корня. Переложите кончики корней вместе с фиксатором в двухмиллилитровую трубку и разложите корневые стебли с помощью рассекающей иглы или щипцов. Постучите по трубке 20 раз, чтобы повторно суспендировать клетки и получить клеточную суспензию.

Далее положите два-три слоя пропитанной водой папиросной бумаги на горячую плиту при температуре 50 градусов Цельсия. Погрузите микроскопические предметные стекла в лед, холодную воду из-под крана в холодильник на 30 минут. Затем поместите предметные стекла поверх влажной папиросной бумаги, нанесите пипеткой от семи до 10 микролитров клеточной суспензии и опустите ее с расстояния 20 сантиметров на охлажденное предметное стекло, размещенное на горячей плите.

Затем нанесите 10 микролитров смеси этанола уксусной кислоты на то же место, что и клеточная суспензия на предметном стекле, и держите предметное стекло на горячей плите. Через две минуты поместите предметное стекло на горячую плиту без влажной салфетки и дайте ему высохнуть еще одну минуту. Проверяйте предметные стекла с помощью микроскопа с контрастом лица, чтобы контролировать качество распространения хромосомы.

Используйте предметные стекла либо в тот же день, либо храните их, погрузив в 96% этанол в банку с коплином при температуре минус 20 градусов Цельсия для предварительной обработки предметных стекол перед рыбой. Поместите предметные стекла в банку с копином, содержащую 50 миллилитров двух XSSC, на пять минут с помощью щипцов. Переложите предметные стекла в банку коплана, содержащую 50 миллилитров 45% уксусной кислоты, на три-10 минут.

Далее переложите слайды в банку коплана, содержащую 50 миллилитров двух XSSC, на 10 минут. Затем переложите предметные стекла в банку с коплином, содержащую 50 миллилитров 4%-ного формальдегида, и погрузите предметные стекла на 10 минут для фиксации хромосом. Удалите формальдегид, промыв предметные стекла три раза в течение четырех минут каждый в банке с коплином, содержащей 50 миллилитров двух XSSC.

Затем обезвожьте предметные стекла в течение двух минут серией 70%, 90% и 100% этанола и высушите слайды в вертикальном положении. Для каждого предметного стекла приготовьте гибридизационный раствор объемом 20 микролитров с использованием 10 микролитров деионизированной формы амида, пять микролитров четырех буферов для гибридизации X, три микролитра зонда и два микролитра свободной воды Dns. Добавьте 20 микролитров раствора для гибридизации на предметное стекло и накройте крышкой размером 24 на 32 миллиметра.

После герметизации покровного стекла резиновым цементом денатурируйте предметные стекла щупами одновременно при температуре 80 градусов Цельсия в течение двух минут на горячей плите, перенесите стекла во влажную камеру и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Избегая попадания света, снимите покровные стекла, промыв предметные стекла в соединительной банке с двумя XSSC. Затем поместите предметные стекла в банку коплана, содержащую от 55 до 60 градусов Цельсия, два XSSC и инкубируйте в течение 20 минут.

Далее поместите слайды по два XSSC в банку с копланом на две минуты при комнатной температуре. Уверенный. Обезвоживайте предметные стекла в банке Coplan в течение двух минут в дозе 70%, 90% и 100% этанола. Воздух. Высушите слайды и покрасьте пятном в монтажной среде Antifa, избегая интенсивного света.

Проанализируйте слайды с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Выбор фильтра зависит от флюорохрома, используемого для маркировки зонда при необходимости. Храните предметные стекла при температуре четыре градуса Цельсия в темных условиях до года.

Показаны митотические метафазные спреды, приготовленные методом получения хромосом с сухим капанием на быстром воздухе. Анализ рыб проводился с использованием как повторяющихся, так и одиночных копий. Изображения были получены с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с набором фильтров, позволяющих возбуждать соответствующие флюорочетверы, и захватывались высокочувствительной ПЗС-монохромной камерой.

Эксперимент с рыбами на митотических метафазных хромосомах клада и вульгари с использованием зонда с одной копией и пяти S-R-D-N-A выявил отчетливые и высококачественные сигналы. Гибридизация микросателлита CT CTT 10 на хромосомах hordy и BULBUS привела к получению специфического и отчетливого паттерна. Эксперимент с рыбами на митотических метафазных хромосомах sala serial с использованием двух зондов PSC 119 привел к получению специфических и высококачественных сигналов.

Очевидными преимуществами такого подхода являются хорошо распределенные, неповрежденные и многочисленные метафазные хромосомы, служащие прекрасной предпосылкой для успешного анализа рыб. После освоения эта процедура может быть выполнена менее чем за два часа, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить высококачественную митотическую мета хромосомную съемку лица для рыбы IDE и бывших, высота может быть чрезвычайно опасной, всегда используйте графики и пленочный капот при выполнении этих процедур.