Стволовых клеток, как

Общая цель данного протокола заключается в использовании эксплантатов крыши бластоцеля или анимального полюса X. laevis для изучения молекулярных механизмов и клеточных процессов, лежащих в основе развития нервной системы in vitro и in vivo. Эти методы позволяют ответить на ключевые вопросы в области биологии развития и стволовых клеток, касающиеся определения судьбы клеток, миграции клеток, а также автономных и неавтономных свойств нейральных клеток. Представленные методики обеспечивают простые, недорогие, универсальные и эффективные инструменты для исследования фундаментальных механизмов поведения ключевых нейральных клеток.

Данные анализы позволяют тестировать детерминанты нейральной судьбы для перепрограммирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и получения зрелых линий клеток нейрального происхождения для дальнейшего скрининга. Как правило, специалисты, впервые применяющие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как данные методики требуют определенной мануальной ловкости. Идея этих методов возникла у меня при планировании анализа поведения сегрегации клеток.

Для изготовления препарата передней части нейральной трубки Xenopus laevis в виде плоского препарата используйте пластическую переносную пипетку, чтобы перенести фиксированный, дегидратированный и регидратированный эмбрион в чашку Петри диаметром 60 мм, заполненную до краев PBT. Затем введите тонкий пинцет между глазами и нейральной трубкой на уровне зрительного нерва и отделите глаза. После этого осторожно введите пинцет под эктодерму, покрывающую нейральную трубку за головой, и аккуратно снимите эктодерму.

После проведения соответствующей гибридизационной маркировки NC2 перенесите эмбрион в новую чашку Петри объемом 60 мл, заполненную PBT, и с помощью тонкого пинцета грубо отделите переднюю часть нейральной трубки от эмбриона. Затем осторожно удалите неплотно прилегающую хорду из-под нейральной трубки. При необходимости удалите отоцистические пузырьки и оставшиеся части мезодермы.

После отсечения всех придатков нервной трубки отделите передний отдел нервной трубки от эмбриона. Затем перенесите изолированную нервную трубку в коническую пробирку объемом 1.5 milliliter, заполненную 50%glycerol и PBS, для инкубации в течение ночи при температуре four degrees Celsius. После повторной ночной обработки в 90%glycerol перенесите нервную трубку на предметное стекло в небольшом количестве глицерина и с помощью вольфрамовых игл рассеките нервные трубки вдоль дорсальной и вентральной срединных линий.

Затем используйте усиливающие кольца, перекрытые покровным стеклом, чтобы закрепить обе стороны нейральной трубки в 90% glycerol и PBS. Чтобы подготовить бусины для индукции экспланта анимальной части, используйте микропипетку P200, чтобы перенести половину аликвоты смоляных бусин, обработанных BSA, в новую пробирку объемом 1,5 мл. Затем замените стерильную дистиллированную воду в новой пробирке 200 µL среды, содержащей исследуемую экспериментальную молекулу, и выдержите в течение двух часов при 4 °C.

По окончании инкубации перенесите эмбрионы на стадии бластулы или очень ранней гаструлы в PBS с кальцием и магнием, дополненный 0,2% BSA. Затем под стереомикроскопом зажмите вителлиновую оболочку боковой стороной одного пинцета и с помощью второго пинцета медленно отделите оболочку с вегетативной стороны эмбриона, стараясь не повредить анимальный полюс. После этого с помощью тонкого пинцета вырежьте небольшой квадрат из анимального полюса каждого эмбриона.

С помощью наконечника пипетки, покрытого BSA, перенесите крышечки в отдельные лунки многолуночного планшета Terasaki с 0,5X модифицированным солевым раствором Барта, расположив пигментированную сторону животного в контакте с круглым дном лунки. С помощью микропипетки P20 выберите самые темно-розовые бусины из пробирки с исследуемым образцом и поместите по одной бусине на каждую крышечку, используя пинцет для центрирования бусин на крышечках. После размещения последней бусины установите планшет на бумагу, смоченную водой, и накройте его пластиковым контейнером перед инкубацией.

Для подготовки диссоциированных и реагрегированных эксплантатов животного полюса выделите от 15 до 30 животных полюсов, как было показано ранее. Используя тонкий пинцет, вырежьте небольшой квадрат ткани из животного полюса. Перенесите эксплантаты в лунку с агарозным покрытием, заполненную бескальциевым солевым раствором Хольтфретера, пигментированной стороной вверх.

Через несколько минут должна начаться дезагрегация. С помощью тонкого пинцета отделите пигментированные слои от остальной части ткани. Затем с помощью микропипетки P20 удалите пигмент.

Когда большинство пигментированных слоев будет удалено, а клетки полностью диссоциируют, осторожно покачайте планшет круговыми движениями, чтобы собрать клетки в центре, и с помощью микропипетки P1000 удалите как можно больше среды, стараясь не задевать клетки. Затем добавьте в лунку один миллилитр физиологического раствора Холтфретера с кальцием. Перенесите диссоциированные анимальные шляпки в пробирку объемом 1,5 миллилитра.

После центрифугирования клеток с помощью микропипетки P1000 аккуратно удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 20 µL физиологического раствора Хольтфретера с кальцием. Оставьте клетки для реагрегации на три–шесть часов при комнатной температуре. Затем медленно добавьте 1 mL 3/4 NAM, чтобы аккуратно отделить эксплантаты от дна пробирки, и с помощью пластиковой переносной пипетки распределите эксплантаты по отдельным планшетам без покрытия.

Для пересадки эксплантатов животного полюса на нервные пластинки Xenopus laevis сначала покройте чашки Петри диаметром 60 мм 3% агарозой и раствором 3/4 NAM, в которой предварительно проделаны небольшие отверстия. Затем перенесите эмбрионы на ранней стадии нейрулы в PBS с кальцием и магнием, дополненный 0,2% BSA, для удаления вителлиновой оболочки. После этого заполните покрытую агарозой чашку для диссекции свежим раствором 3/4 NAM и перенесите эмбрионы в чашку дорсальной стороной вверх.

Теперь перенесите реагрегированный эксплантат анимального полюса на препаровальную пластину, позволяя эксплантату медленно опуститься на дно чашки под действием силы тяжести, как только кончик пипетки пересечет поверхность NAM. Затем под стереомикроскопом с помощью закругленных пинцетов зафиксируйте эмбрион и с помощью вольфрамовой иглы сделайте надрез в области нервной пластинки для имплантации эксплантата. Вырежьте небольшой фрагмент реагрегированного эксплантата анимального полюса, используя закругленные пинцеты и бровный нож.

Используйте фрагмент ткани, чтобы определить размер кусочка экспланта для трансплантата. На этом рисунке показаны плоские препараты передних отделов нейральных трубок X laevis и X tropicalis на стадиях 30, 32 и 35 после двойной гибридизации NC2 по всему препарату, как было продемонстрировано выше. Как видно на этих изображениях, экспрессия xenopus sonic hedgehog обнаруживается в клетках, контактирующих с бусинами, пропитанными кондиционированной средой с добавлением концевого терминала гена sonic hedgehog, но не в клетках, контактирующих с бусинами, обработанными контрольной средой.

После диссоциации и реагрегации, как было только что продемонстрировано, данные эксплантаты с антериоризированными клетками животного полюса смешивали с антериоризированными клетками животного полюса, экспрессирующими Otx2. Как видно, клетки, экспрессирующие Otx2, не отделялись от клеток, не экспрессирующих Otx2. Оба типа клеток свободно перемешивались по всему эксплантату.

Напротив, в эксплантах, где клетки, экспрессирующие Otx2, были смешаны с клетками, экспрессирующими BAR HL-2, Otx2 и IRX3, клетки с экспрессией нескольких генов образовали сплошные участки, которые не распространялись равномерно внутри реагрегированного экспланта. При пересадке в переднюю часть нейральной пластинки эмбрионов x laevis, как было продемонстрировано выше, смешанные экспланты, состоящие из клеток, коэкспрессирующих BAR HL-2, Otx2 и IRX3, в сочетании с клетками, экспрессирующими N-конец sonic hedgehog, демонстрировали эндогенную экспрессию sonic hedgehog и отделялись от клеток переднего нейрального эпителия. В то же время, когда в нейральную пластинку x laevis пересаживали смешанные экспланты, состоящие из клеток, экспрессирующих Otx2 и N-конец sonic hedgehog, пересаженные клетки не экспрессировали sonic hedgehog и не отделялись от соседних клеток.

После освоения пересадка экспланта анимальной шапочки на эмбриональные нейральные пластинки может быть выполнена за два-три часа, в зависимости от количества пересаженных эмбрионов. Это очень надежный и эффективный метод. При выполнении данной процедуры крайне важно соблюдать осторожность, чтобы избежать бактериального и грибкового загрязнения.

После проведения процедур трансплантации можно применить другие методы, такие как гибридизация in situ на целых препаратах, чтобы проследить судьбу и поведение трансплантированных клеток. Программы развития, лежащие в основе органогенеза нервной трубки, в значительной степени консервативны, особенно у позвоночных. Таким образом, данные, полученные на амфибиях, расширили наше понимание клеточных и молекулярных процессов, лежащих в основе развития позвоночных.