Строительство модульных гидрогеля листов для Micropatterned Макро-масштабного 3D Cellular архитектуры

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать простое изготовление, манипуляции и сборку модульных гидрогелевых листов для системы 3D-культивирования клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии, такие как создание большего количества функциональных инженерных тканей in vivo с культивируемыми микросредами. Основное преимущество этого метода заключается в том, что клеточные гидрогелевые конструкции могут быть созданы без какого-либо дорогостоящего приращения.

Условия 3D-культивирования клеток будут зависеть от каждого модульного гидрогелевого листа. Применение этого метода распространяется на улучшенные клеточные анализы и биологические исследования, поскольку этот метод может обеспечить различную геометрию и состав трехмерных клеточных микро- и макросред. Хотя этот метод может дать представление о клеточных анализах in vitro, он также может быть применен к другой системе, такой как трансплантируемый каркас 3D-модели ткани.

Начните с создания желаемых микромасштабных узоров с использованием стандартных методов фотолитографии. В примере, показанном в этом видео, будет использоваться сетчатая структура, похожая на дольку печени, как показано здесь. Далее отвесить 2,5 грамма PDMS и 2,5 грамма раствора отвердителя и тщательно перемешать компоненты.

Дегазируйте раствор в вакуумной камере, а затем равномерно распределите смешанный раствор по поверхности микроузора кремниевой пластины в форме для литья из фольги. Затем отверждите PDMS, поставив блюдо на плоскую поверхность нагреваемой при температуре 65 градусов Цельсия тарелки на 90 минут. После отверждения извлеките PDMS из формовочной формы и осторожно отсоедините его от кремниевой пластины.

Отрежьте края PDMS и поместите узорчатую часть на чашку Петри диаметром 100 мм так, чтобы стороной микроузора была обращена вверх. Затем промойте PDMS с микроструктурой 70% этанолом, а затем дистиллированной водой для первичной стерилизации. После этого полностью высушите набор в течение 10 минут в духовке при температуре 65 градусов Цельсия.

Затем поместите микроструктурированные формы PDMS в плазменный очиститель и очистите их в течение одной минуты, чтобы создать гидрофильную поверхность. Это облегчит загрузку водных жидкостей. Затем покройте поверхность PDMS 100 миллилитрами раствора поверхностно-активного вещества, указанного в Таблице материалов.

Инкубируйте образцы на лабораторной коромысле в течение не менее трех часов. Далее смойте раствор поверхностно-активного вещества из форм PDMS с помощью стерильной воды, и полностью высушите их в духовке при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем простерилизуйте каждую микроструктурированную форму, подвергнув ее воздействию ультрафиолетового излучения в течение 30 минут.

Начните с культивирования клеток hepg2 с использованием стандартных методов. После того, как клетки слились на 70-80%, промойте клетки один раз с помощью PBS. Затем соберите клетки, добавив один миллилер 05% трипсин эдта и инкубируя их в течение четырех минут при 37 градусах Цельсия.

После отделения соберите клетки в центрифужную пробирку и гранулируйте их по 250 г в течение трех минут. Удалите надосадочную жидкость, а затем повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре PBS. Подсчитайте количество отдельных распределенных ячеек в PBS с помощью автоматического счетчика ячеек.

Затем снова гранулируйте ячейки по 250 г в течение трех минут. Удалите надосадочную жидкость PBS и добавьте в клетки достаточное количество однопроцентного раствора альгината натрия, чтобы конечная плотность посева составила от пяти до десяти миллионов клеток на миллиметр. Осторожно перемешайте клеточный раствор с помощью пипетки, а затем инкубируйте клеточную гидрогелевую суспензию в пятипроцентном увлажнённом CO2-инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия.

Пока клетки инкубируются, поместите микроструктурированные формы PDMS в очиститель плазмы и очистите их в течение одной минуты при мощности 85 Вт, чтобы создать гидрофильную поверхность. Смешайте клеточную гидрогелевую суспензию, аккуратно пипетируя вверх и вниз, а затем постепенно загрузите 7,2 микролитра суспензии на край микрорисунка в форму. Затем гелеобразите гелевую суспензию клеточной гидрогелевой суспензии, создавая туман сшивающего реагента с помощью увлажнителя со скоростью 250 миллилитров в час и распыляя его на гидрогелевый предшественник в течение пяти минут.

Убедитесь, что эта процедура охватывает топографическую поверхность пресс-формы PDMS в пределах пяти сантиметров. Следуя процессу сшивки, выключите увлажнитель воздуха и заполните форму PDMS PBS. С помощью пипетки объемом 200 микролитров аккуратно распределите PBS по краю затвердевших гидрогелевых листов, чтобы отделить каждый из гидрогелей.

Затем возьмите каждый плавающий гидрогелевый лист с помощью наконечника для пипетки объемом 1 000 микролитров. Переложите каждый лист гидрогеля в отдельные лунки 12-луночной пластины, содержащей один миллилер предварительно подогретого DMEM, чтобы они плавали на поверхности среды. Культивируйте клетки таким образом в течение одной недели, меняя питательную среду через день.

Затем изготовьте раму PDMS, которая содержит столбчатые структуры высотой 170 микрон на нижней поверхности, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Во время изготовления поместите специальную форму из поликарбоната на кремниевую пластину для рамы PDMS, чтобы создать внутреннюю раму шириной восемь миллиметров, высотой девять миллиметров и глубиной двух миллиметров. После стерилизации поместите рамку PDMS на четверть листа нейлоновой фильтровальной бумаги, установленной в 60-миллиметровой чашке Петри.

Извлеките гидрогелевые листы из инкубатора и перенесите первый из модульных гидрогелевых листов внутрь рамки PDMS с помощью наконечника для пипетки объемом 1 000 микролитров. Совместите край модульного гидрогелевого листа с рамкой PDMS с помощью пустого наконечника для пипетки объемом 200 микролитров. Повторите этот процесс с дополнительными гидрогелевыми листами, пока не получится стопка из четырех-шести слоев.

Затем удалите питательную среду, пропустив ее через столбчатые конструкции в нижней части рамы PDMS. Затем добавьте два микролитра двухпроцентного раствора альгината в один угол многослойной конструкции. Используя увлажнитель воздуха, распылите туман сшивающего реагента со скоростью 250 миллиметров в час на многослойную конструкцию в течение тридцати секунд, чтобы соединить края каждого слоя вместе.

Затем аккуратно промойте многослойную конструкцию 400 микролитрами DMEM и снимите рамку PDMS с помощью пинцета. Затем добавьте еще четыре миллилитра DMEM. Отделите многослойную конструкцию от фильтровальной бумаги, аккуратно протерев ее клеточным подъемником, а затем с помощью фильтровальной бумаги перенесите ее на шестилуночный планшет, содержащий три миллилитра DMEM.

Культивируйте клетки плавающим способом с помощью гидрогелевой конструкции в виде многомасштабного клеточного каркаса в шестилуночном планшете в течение не менее одной недели. Меняйте питательную среду через день. Здесь показан результат послойной сборки микропаттерированных гидрогелевых листов, похожих на дольки печени, где клетки карциномы печени человека, флуоресцирующие зеленым цветом, и фибробласты NIH-3T3, флуоресцирующие красным цветом, были выращены вместе в совместной культуре на комбинированной сетке.

Используя представленную здесь технику, можно создать множество вариаций узора, включая шестиугольные столбы, тонкие сетки, целые массивы и множественные микроволокна, похожие на микрогребенки, в форме тонкой гидрогелевой конструкции размером от 100 до 200 микрометров. Эти структуры обеспечивают богатую 3D-среду для культивирования различных типов клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создавать клеточные гидрогелевые листы для инженерных in vivo 3D-систем культивирования снизу вверх.