Количественная рыба плавание поведение в ответ на Острое отравление водного раствора меди с помощью с помощью компьютера видео и цифрового анализа изображений
26 февраля 2016 г.
Измерение воздействия загрязнителей окружающей среды на поведение рыбы часто субъективны и сложным особенно при работе с сублетальных. Описаны методы , включая видео технологию для количественной оценки плавание поведение ранней жизни стадии белого осетра (Acipenser transmontanus) во время и после 96 ч острого воздействия различных концентраций меди.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать, как количественно оценить поведенческие реакции у белого осетра на сублетальное воздействие водной меди. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области экотоксикологии, например, как сублетальное воздействие загрязняющих веществ влияет на плавательное поведение рыб. Этот метод может дать важную информацию для сохранения белого осетра.
Его также можно легко применять к другим видам рыб, амфибиям и беспозвоночным. Основное преимущество этого метода заключается в том, что реакция является высокочувствительной, обеспечивает раннее указание на токсичность и имеет отношение к выживанию организма. Первоначально этот метод может быть сложным, если человек не знаком с проведением поведенческих измерений.
Демонстрировать протокол будет мой соавтор Холли Пульис. Сначала приготовьте два литра водного реагента марки два сульфата меди пентагидрата. Далее уравновесьте систему разбавителя и емкости для экспозиции.
Поместите входную трубку от автоматического дозатора шприцев в колбу с исходным раствором. Затем установите объем автоматического спайка насоса на один миллилитр и включите разбавитель. Система создает серию 50%-ного разбавления из пяти концентраций и контроль.
Через четырехходовой разветвитель эти растворы подаются в четыре реплицирующие экспонирующие камеры. Далее включаем насос для чиллера, настроенного на поддержание водяной бани на уровне 15 градусов Цельсия. Теперь, используя автоматический таймер на разбавлении, установите его на цикл каждые 30 минут.
Уровень воды в резервуарах поддерживается за счет стока. Подготовьте экспозиционные камеры, поставив сбоку четырехсантиметровое отверстие, и накрыв отверстие сеткой из нержавеющей стали толщиной 30 микрон. Обязательно подбирайте экспозиционные камеры, которые вмещают не менее одного литра воды на 10 грамм рыбы.
Например, 89-дневный белый осетр весит около 373 миллиграммов, и, таким образом, может быть протестирован в квадратной камере размером 28 на 13 целых пять сантиметров на 25 сантиметров. В начале, в середине и в конце эксперимента соберите 24 миллилитровые подобразцы тестового раствора для химического анализа. Используйте соломинки-сиптели, прикрепленные к пластиковым шприцам.
Замените соломинку для сиппера на полиэфирсульфоновый фильтр с нулевым значением четыре целых пять микрон и пропустите через фильтр четыре миллилитра тестовой воды. Утилизируйте эту воду. Затем отфильтруйте оставшиеся 20 миллилитров воды в очищенную от кислот полиэтиленовую бутылку.
Подкислите образец 16 молярной азотной кислотой до 1% по объему. Затем эти образцы могут храниться до трех месяцев. Как только тестовые воздействия подтвердятся, заселите трех осетров в каждую тестовую камеру из расчета около 172 миллиграммов рыбы на литр камеры.
Соберите осетровых с помощью неабразивной сачки, и переложите их в небольшое ведро. Всего для сбора данных с шести тестовых решений необходимо 144 рыбы. В течение 96 часов воздействия не кормите рыб.
Необходимо проводить последовательные ежедневные наблюдения для оценки смертности и аномального поведения. Утро — лучшее время суток для этого, и в идеале наблюдатель должен быть слеп к условиям испытания. Потеря равновесия определяется как неспособность рыбы сохранять вертикальное положение в толще воды.
Неподвижность определяется как неспособность рыбы двигаться или плавать, если ее не подтолкнуть. Также фиксируйте любые другие отклонения, такие как вялость, гиперактивность, увеличение или уменьшение дыхания, изменение цвета, тремор, спазмы, вздутие живота, положение в толще воды и любые другие необычные закономерности плавания. Мертвую рыбу всегда следует немедленно удалять.
Каждый день также измеряйте уровень растворенного кислорода с помощью портативного измерителя из двух проб воды. По окончании 96-часового сеанса снимите видео для анализа поведения при плавании. Поместите испытательную арену в резервуар для экспонирования.
Обязательно подбирайте тестовую арену, достаточно большую, чтобы рыба могла свободно плавать. Прямо над каждой испытательной ареной установите ручную видеокамеру на штативе. Теперь из обработанных рыб случайным образом выберите до трех выживших.
Перенесите трех на тестовую арену с помощью небольшой сетки. Дайте рыбкам акклиматизироваться к арене около 30 минут. Пока рыба акклиматизируется, сфокусируйте изображение, сведите к минимуму блики от движущейся воды и максимизируйте контраст рыбы на фоне, регулируя вид так, чтобы рыба не была затенена.
Как только рыба акклиматизируется, начните запись и соберите две минуты видеоданных. После съемки видео усыпьте и утилизируйте рыбу. После преобразования видеофайлов в формат, необходимый для программного обеспечения для цифрового анализа, откройте программу отслеживания и выберите новый эксперимент по умолчанию в разделе «Создать новый эксперимент» на главном экране.
Заполните подсказки и нажмите OK. Затем перейдите к параметру настроек эксперимента в разделе Настройка и выберите Из видеофайла в разделе Источник видео. Установите количество арен равным одной.
Установите количество объектов на арене равным трем. Затем выберите обнаружение центральной точки в разделе Отслеживаемые объекты и выберите нужные единицы измерения. Теперь в разделе «Настройка» выберите опцию «Список пробных версий» и нажмите «Добавить видео» в верхней части экрана.
Выберите алфавитный порядок в диалоговом окне. Нажмите «Обзор». Перейдите в папку, в которой находятся видео, выделите соответствующие файлы и нажмите «Открыть».
Теперь, когда видеофайлы выбраны, перейдите к определению объема эксперимента в программном обеспечении. Сначала нажмите кнопку Добавить переменную в верхней части экрана и введите концентрацию в поле метки. Введите концентрацию меди в микрограммах на литр в поле описания.
Затем выберите числовой из выпадающего списка для типа. Нажмите на поле с предопределенными значениями и выберите опцию «Определить отдельные значения» в диалоговом окне. Введите концентрации, используемые для эксперимента, нажимая кнопку «Добавить» между каждым сложением чисел.
Затем снимите галочку с опции «Разрешить другие значения» и нажмите «ОК». Выберите пробную версию в раскрывающемся меню в поле объема работ. Введите соответствующую концентрацию для каждого испытания в соответствующие поля.
Нажмите кнопку Добавить переменную в верхней части экрана. Введите replicate в поле с надписью. Введите номер репликации в поле описания.
Выберите номер из выпадающего списка для типа. Затем нажмите на поле предопределенных значений и выберите опцию определения отдельных значений в диалоговом окне. Введите один, два, три и четыре и снимите флажок «Разрешить другие значения».
Затем нажмите OK. Теперь выберите вариант пробной версии в выпадающем меню в поле области. Введите соответствующий номер репликации для каждой пробной версии.
Следующая задача — обустроить пространства арены. Начните с выбора настроек арены на вкладке «Настройка» и назовите первую настройку как пробную. В диалоговом окне выберите опцию захвата фонового изображения и нажмите кнопку Обзор.
Найдите видеофайл для первой пробной версии и нажмите «Открыть». После того, как видео появится, нажмите «Захват» в диалоговом окне «Захват фонового изображения». Затем нажмите на значок белого круга в верхней части экрана в настройках арены и манипулируйте кругом, который окружает зону для плавания.
Затем нажмите на значок калибровочной шкалы в разделе «Настройки арены». Используйте движение щелчка-удержания-перетаскивания, чтобы выбрать место на арене. Теперь в поле реального расстояния в калибровочном расстоянии введите 10 целых пять десятых.
Затем нажмите OK. При необходимости отрегулируйте калибровочную линию так, чтобы она охватывала весь диаметр круглой арены. Нажмите на опцию «Проверить настройки арены» в окне настроек арены и устраните все проблемы в настройках, которые не были проверены.
Теперь повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будут определены все арены для каждого испытания. Далее задаем параметры обнаружения рыбы. Сначала выберите настройки обнаружения в разделе «Настройка» на панели инструментов «Исследование эксперимента» в левой части экрана.
Затем выберите динамическое вычитание из выпадающего меню в разделе метод в диалоговом окне настроек обнаружения. Кроме того, выберите цвет заливки для каждого объекта в разделе «Идентификация объекта» в диалоговом окне. Затем выберите «Выбрать видео» и найдите видео для пробной версии.
В настройках детектирования один диалог, заполните поле частоты дискретизации под видео пятью целыми девять девять четыре одним. В том же поле нажмите «Настройки» для параметра «Эталонное изображение» в разделе «Обнаружение». Затем нажмите на опцию «Начать изучение C» в диалоговом окне эталонного изображения.
Как только изображение в диалоговом окне эталонного изображения появится без животных, нажмите кнопку Использовать динамическое эталонное изображение в настройках сбора данных в диалоговом окне и закройте это диалоговое окно. Теперь выберите темнее из выпадающего меню для объекта, находящегося под обнаружением, в диалоговом окне настроек обнаружения. Для темного контраста при обнаружении установите меньшее число на 33, а большее — на 153.
Затем нажмите «Сохранить изменения» в правом нижнем углу. Теперь убедитесь, что программное обеспечение успешно отслеживает животных, а не тени или мусор. Нажмите кнопку воспроизведения в диалоговом окне управления воспроизведением и при необходимости отрегулируйте цифры для темного контраста.
Обязательно сохраните все внесенные корректировки. Теперь программное обеспечение настроено на сбор данных с видео, поэтому следующей задачей будет отслеживание рыбы в каждом испытании. Сначала выберите «Извлечение» в разделе «Настройка» на панели инструментов обозревателя экспериментов в левой части экрана.
Затем нажмите кнопку Отслеживать следующую запланированную пробную версию в диалоговом окне настроек сбора данных и убедитесь, что все настройки пробной версии, видео и арены отображаются в разделе настроек сбора. Затем отметьте опцию обнаружения определяет скорость в диалоговом окне управления захватом. Нажмите кнопку с зеленым кругом, заключенным в белый квадрат, чтобы начать процесс приобретения.
Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будут отслежены все испытания. Теперь отслеживаемые объекты, являющиеся рыбами, могут быть проанализированы. Сначала нажмите на профили данных под параметром анализа на панели инструментов обозревателя экспериментов в левой части экрана.
Затем выберите время в разделе «Вложенность» на панели инструментов компонентов. Под настройкой выбора временного интервала трека в диалоговом окне времени установите значение до на две минуты и нажмите OK. Затем перетащите коробку вложения между начальной рамкой и результирующей ячейкой в области профилей данных в правой части экрана.
На панели инструментов обозревателя экспериментов в левой части экрана найдите опцию анализа и нажмите на профиль анализа. Затем на панели инструментов зависимых переменных под курсом расстояния и времени нажмите на скорость. Нажмите кнопку Добавить, а затем под заголовками расстояния и времени на панели инструментов зависимых переменных нажмите Расстояние перемещено.
Затем нажмите кнопку Добавить в диалоговом окне перемещения расстояния, а затем под заголовком индивидуального поведения на панели инструментов зависимых переменных нажмите кнопку Перемещение. В диалоговом окне движения загляните под заголовок фильтра выбросов и установите интервал усреднения равным единице. Затем под заголовком порога отрегулируйте начальную скорость до двух целых ноль и отрегулируйте стоп-скорость до одной целой семь пять.
Под параметром Рассчитать статистику по заголовку отметьте оба поля для перемещения и неперемещения. Затем нажмите кнопку Добавить, а затем под параметром результатов на панели инструментов обозревателя экспериментов в левой части экрана нажмите Выходные данные анализа. Теперь нажмите кнопку Рассчитать.
После того, как зависимые переменные будут рассчитаны, нажмите «Экспорт» в верхней части экрана. Выберите папку назначения в диалоговом окне вывода экспорта анализа и выберите Excel в раскрывающемся меню типа файла. Затем нажмите OK.
Наконец, нажмите «Сохранить эксперимент» на вкладке «Файл» в верхней части экрана. Закройте программное обеспечение для цифрового отслеживания. Импортируйте данные в файл электронной таблицы и проанализируйте их с помощью коммерческого программного обеспечения для статистического анализа.
Уже через 72 часа после воздействия меди в различных концентрациях, через два дня после вылупления у осетра наблюдалось множество наблюдаемых отклонений. Это оказало очевидное влияние на поведение при плавании. Видеоданные помогли определить это поведенческое нарушение.
В дальнейших испытаниях осетр через 30 дней после вылупления оказался чувствительным к воздействию меди в течение 96 часов. Скорость плавания, время, затрачиваемое на движение, и пройденное расстояние значительно снижались с увеличением концентрации меди. Пути плавания также сократились с увеличением концентрации меди.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как количественно оценить поведение в тесте на токсичность. Этот метод может предоставить менеджерам по охране окружающей среды возможность использовать поведенческие критерии для документирования повреждений окружающей среды и руководства восстановлением. При проведении этой процедуры важно помнить о необходимости быть последовательным при записи поведенческих наблюдений.
Другие модели поведения, такие как кормление и агрессия, могут быть количественно оценены с помощью этой процедуры, чтобы ответить на дополнительные вопросы о долгосрочном воздействии загрязнения на выживание.
Обзор
В данном исследовании представлен метод количественной оценки плавательного поведения белого осетра (Acipenser transmontanus) на ранних стадиях развития при воздействии sublethal концентраций меди. С помощью технологий видеоанализа исследователи могут объективно оценивать поведенческие реакции, что позволяет получить представление о влиянии загрязнителей окружающей среды на рыб.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Экотоксикология
- Поведение рыб
- Экология
Теоретическая часть
- Оценка воздействия загрязняющих веществ на гидробионтов имеет решающее значение для усилий по сохранению природы.
- Сублетальное воздействие может повлиять на плавательное поведение, которое жизненно важно для выживания.
- Традиционные методы измерения могут быть субъективными и затруднительными.
- Видеотехнологии предлагают более объективный подход к поведенческому анализу.
Цель исследования
- Разработать протокол для количественной оценки поведенческих реакций белого осетра на воздействие меди.
- Представить метод, применимый к другим видам водных организмов.
- Углубить понимание ранних индикаторов токсичности у рыб.
Используемые методы
- Приготовление водных растворов меди для экспозиции.
- Использование автоматизированных систем для точного дозирования концентраций.
- Поведенческие наблюдения и видеозапись рыб во время экспозиции.
- Анализ видеоданных для количественной оценки плавательного поведения.
Основные результаты
- Наблюдались поведенческие изменения в ответ на варьирование концентрации меди.
- Видеоанализ позволил получить количественные данные о характере плавания.
- Сублетальное воздействие привело к измеримым эффектам в поведении рыб.
- Метод оказался чувствительным и применимым для оценки токсичности.
Выводы
- Разработанный протокол эффективен для изучения влияния загрязняющих веществ на поведение рыб.
- Результаты исследования вносят вклад в область экотоксикологии и сохранения популяций рыб.
- Данный метод может быть адаптирован для использования с другими водными организмами.
Часто задаваемые вопросы
Промышленное значение
Количественная оценка сублетальных поведенческих реакций рыб на ранних стадиях развития служит ранним предупреждающим индикатором токсичности загрязняющих веществ, который проявляется раньше, чем влияние на выживаемость, рост или репродуктивные функции. Такой подход способствует механистическому снижению рисков в экологической токсикологии, связывая молекулярное воздействие с функциональными нарушениями на уровне организма, что обеспечивает прогностическую достоверность при оценке опасностей. Адаптивность данного метода к различным видам и стрессорам повышает его полезность в программах скрининга для оценки безопасности водной среды.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать функциональные нарушения, вызванные токсикантами, на моделях позвоночных, что способствует валидации мишеней посредством фенотипической привязки молекулярных инициирующих событий.
- Практическая ценность: обеспечивает количественные объективные поведенческие конечные точки, которые снижают вариабельность и повышают воспроизводимость при первичном скрининге на токсичность.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Позволяет получить данные зависимости «доза-эффект» для скорости плавания, пройденного расстояния и частоты движений в качестве количественных зависимых переменных для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: Обеспечивает временной трекинг поведения с высоким разрешением, что позволяет определять время наступления эффекта и подтверждает готовность анализа к скринингу загрязнителей окружающей среды.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Связывает сублетальные поведенческие изменения с исходами, влияющими на выживаемость, что способствует трансляционному согласованию биомаркеров между ранним функциональным нарушением и риском на популяционном уровне.
- Практическая ценность: Обеспечивает непрерывность анализа от молекулярного воздействия через фенотипическую привязку к апикальным конечным точкам, что позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении при профилировании безопасности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в исследовательскую биологию, обеспечивая фенотипические показатели, которые позволяют проверять гипотезы о механизмах действия токсикантов и уточнять сигнальные пути на этапе предварительного скрининга.
- Поиск новых биологических мишеней: способствует снижению рисков при изучении механизмов за счет количественной оценки функциональных нарушений плавательного поведения как прямого показателя нейротоксического или скелетно-мышечного воздействия.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные и воспроизводимые поведенческие метрики, позволяющие проводить надежную оценку соединений или загрязнителей при различных концентрациях и временных интервалах.
- Аналитика: выходные данные включают скорость, пройденную дистанцию и частоту движений, что позволяет проводить сравнительный анализ эффектов воздействия и использовать статистическое моделирование зависимостей «доза — ответ».
- Трансляционные исследования: связывают ранние поведенческие нарушения с показателями выживаемости, обеспечивая переход от этапа поиска к доклинической валидации для оценки экологических рисков.
- Корпоративное повторное использование: рабочий процесс видеоотслеживания применим к различным видам, стадиям жизненного цикла и стрессорам, что делает его универсальной платформой для поведенческой экотоксикологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов за счет выявления сублетальных эффектов на более ранних стадиях, чем традиционные конечные точки, что снижает количество ложноотрицательных результатов при идентификации опасностей.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию и масштабируемость благодаря автоматизированному сбору видеоматериалов и цифровому анализу, что минимизирует субъективность наблюдателя и увеличивает пропускную способность.
- Стратегическая ценность: обеспечивает основу для принятия решений о продолжении или прекращении исследований в рамках оценки экологических рисков, предоставляя данные о механизмах на уровне организма, что снижает зависимость исключительно от апикальных конечных точек.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию загрязнителей или классов химических веществ на основе рисков с учетом профилей поведенческой чувствительности, повышая эффективность использования ресурсов в программах тестирования безопасности.
Рекомендации по реализации
- Требуются экспертные знания в области экотоксикологии, видеорегистрации поведения и работы с программным обеспечением для цифрового анализа изображений.
- Работа зависит от наличия контролируемых климатических камер, автоматизированных систем разбавления и калиброванных систем видеозаписи при стандартизированном освещении и температуре.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов оценки поведения, параметров записи видео и порогов анализа для обеспечения воспроизводимости результатов в разных лабораториях.
- Адаптация к альтернативным модельным системам требует валидации размера арены, параметров детектирования и поведенческих конечных точек, соответствующих локомоции и морфологии конкретного вида.
- Практические ограничения включают необходимость проведения эвтаназии после экспозиции для видеозахвата, что исключает лонгитюдное наблюдение за одними и теми же особями, а также возможные помехи для точности видеотрекинга из-за мутности или наличия частиц мусора в среде.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Preparing the Cooper-exposure Test Chambers
3:12
Exposing Fish to Test Chemical
4:43
Videotaping Smimming Behavior
5:50
Analyzing the Swimming Activity Video: Part 1
11:35
Analyzing the Swimming Activity Video: Part 2
14:43
Results: The Impact of 3 Days of Aqueous Copper Exposure on Young Sturgeon
15:31
Conclusion
