Выделение конкретных областей генома и идентификации Associated молекул enChIP

Общая цель этой процедуры заключается в выделении определенного участка генома, сохраняющего молекулярные взаимодействия для идентификации молекул, взаимодействующих с этим участком генома. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области геномных функций, таких как транскрипция и эпигенетическая регуляция. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет напрямую идентифицировать молекулы, взаимодействующие с определенной областью генома.

Демонстрировать процедуру будет Тосицугу Фудзита, доцент из моей лаборатории. Следуя текстовому протоколу, сконструируйте интересующие вас ДНК-связывающие молекулы. Это влечет за собой генерацию интересующей последовательности gBlock и ее встраивание в ретровирус, например, для получения направляющей РНК в комплексе с тремя FLAG-dCas9.

В качестве альтернативы можно получить три белка FLAG-TAL, распознающих целевую последовательность. Затем, следуя текстовому протоколу, заражают клетки подготовленным ретровирусом. Подтвердите экспрессию сконструированных ДНК-связывающих молекул и установите клеточную линию.

Теперь приступайте к сшиванию клеток формальдегидом. Суспензируйте 20 миллионов трансфицированных клеток в 30 миллилитрах обычной питательной среды и добавьте 810 микролитров 37%-ного формальдегида для получения конечной концентрации 1%-ной. Инкубируйте смесь в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия. Через пять минут убейте реакцию сшивания, добавив 3,1 миллилитра 1,25 молярного глицина.

Дайте клеткам постоять при комнатной температуре в течение 10 минут, прежде чем продолжить. Затем центрифугируйте трубку с клетками при 300 G в течение пяти минут в охлаждаемой центрифуге. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и промойте клеточную гранулу в 30 миллилитрах PBS путем перемешивания и центрифугирования.

Выполните две промывки PBS. При необходимости промытые гранулы неподвижных элементов могут храниться при температуре минус 80 градусов Цельсия. Продолжая дальше, соберите хроматин из клеток.

Суспензируйте их в 10 миллилитрах буфера для лизиса и инкубируйте на льду в течение 10 минут. Затем, используя охлаждаемую центрифугу, соберите клетки и осторожно выбросьте надосадочную жидкость. Теперь суспензируйте клеточную гранулу в буфере для ядерного лизиса и инкубируйте ее на льду в течение 10 минут.

Каждые несколько минут во время инкубации смесь ненадолго переворачивается. Снова соберите клетки методом центрифугирования. Теперь промойте гранулу 10 миллилитрами PBS и удалите раствор для промывки еще одним центрифугированием.

В результате образуется хроматиновая фракция, которая, при желании, может быть заморожена и храниться при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Продолжайте суспензию гранулы хроматина в 800 микролитрах модифицированного лизисного буфера три и перенесите суспензию в меньшую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Теперь включите ультразвуковой щуп на третьем уровне мощности в непрерывном режиме.

Чтобы фрагментировать хроматин, вручную циклически переключайтесь между 10 секундами ультразвуковой обработки и 20 секундами на льду. На каждом 5-м или 6-м цикле продлевайте ледовую фазу до двух минут, чтобы образец не перегревался. Выполните этот цикл ультразвуковой обработки от 10 до 18 раз, не допуская попадания кончика зонда в дно пробирки, чтобы избежать вспенивания образца.

После ультразвуковой обработки соберите образец с помощью быстрого охлаждаемого центрифугирования. Затем перенесите надосадочную жидкость, содержащую фрагментированный хроматин, в новую пробирку и выбросьте гранулу. О том, как оценить фрагментацию, см. текстовый протокол.

Чтобы подготовиться к иммунопреципитации, сначала конъюгируйте антитела к Dynabeads. Этот иммунопреципитация масштабируется до образцов, полученных из 20 миллионов клеток. Добавьте 1/5 объема модифицированного буфера для лизиса три с Triton X-100 к фрагментированному хроматину для получения конечной концентрации 1% Triton.

Далее добавьте смесь к магнитным шарикам, конъюгированным с обычным мышиным IgG. Инкубируйте реакцию в течение часа на ротаторе с охлаждением. Позже притяните бусины из раствора в течение трех минут на магнитную подставку.

Затем соберите надосадочную жидкость. Перенесите надосадочную жидкость в трубку с магнитными шариками, конъюгированными с антителами anti-FLAG. Запустите эту реакцию конъюгации в течение ночи на вращателе при температуре четыре градуса Цельсия.

На следующее утро приложите магнит к трубке на три минуты, чтобы собрать бусины. Затем извлеките надосадочную жидкость пипеткой и выбросьте ее. Теперь промойте бусины.

Суспензируйте их в одном миллилитре буфера с низким содержанием соли и инкубируйте в течение пяти минут на ротаторе при четырех градусах Цельсия. После инкубации изолируйте намагниченность бусин и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг промывки с буфером с низким содержанием соли еще раз.

Используя ту же технику, выполните еще две промывки с использованием буфера с высоким содержанием соли. Продолжайте использовать метод, чтобы дважды промыть бусины в буфере из хлорида лития. Наконец, промойте бусины с помощью TBS-IGEPAL CA-630 всего один раз.

После семи этапов стирки суспензируйте шарики в 200 микролитрах буфера для элюирования и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Затем притяните шарики путем намагничивания и соберите надосадочную жидкость в новую пробирку. Повторите этот шаг элюирования, чтобы увеличить урожайность.

Затем очистите около 5% ДНК, чтобы оценить выход. Начните с смешивания основной массы элюата в реакцию осаждения. Осаждите хроматин в течение ночи при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

На следующий день центрифугируйте образец и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте гранулу миллилитром 70%-ного этанола и повторите центрифугирование в течение 10 минут. Затем выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте гранулу в 40 микролитрах 2x буфера для проб.

Теперь зажмите подвеску на целых пять минут. Затем инкубируйте его при температуре 100 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы денатурировать и обратить вспять сшивку. После закипания вылейте 40 микролитров образца на гель SDS-PAGE.

Обычно используется градиент от 4 до 20%. Запускайте гель до тех пор, пока краситель не опустится на один сантиметр ниже лунки. Затем окрасьте гель и разрежьте его на пять частей длиной около 2 миллиметров.

Разведите белок из кусочков геля и используйте его для масс-спектр-анализа. Очистка РНК с последующим анализом секвенирования описаны в текстовом протоколе. В целом, до 10% целевых областей генома могут быть очищены с помощью enChIP.

Здесь представлены результаты анализов, нацеленных на промоторную область гена IRF-1 в сравнении с неспецифическим локусом Sox2. Другим примером является нацеливание теломер в сравнении с неспецифическим гамма-спутниковым локусом. enChIP SILAC идентифицировал несколько белков, связанных с промотором IRF-1 гамма-специфичным для интерферона способом.

Теломер-связывающие белки также были идентифицированы с помощью enChIP в сочетании с масс-спектрометрией. Затем секвенирование РНК enChIP было использовано для идентификации РНК, ассоциированных с теломерами. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области транскрипции и эпигенетической регуляции для изучения таких механизмов в различных биологических системах.