Неонатальной спинного мозга мыши Сжатие Травма Модель
27 марта 2016 г.
В этой статье описывается метод создания воспроизводимой компрессионной травмы спинного мозга (ТСМ) у неонатальной мыши. Модель предоставляет благоприятную платформу для изучения механизмов адаптивной пластичности, лежащих в основе спонтанного функционального восстановления.
Общей целью этой процедуры является выполнение воспроизводимой компрессионной травмы спинного мозга у неонатальной мыши. Это достигается путем предварительного глубокого обезболивания мыши. Затем выполняется дорсальная ламинэктомия для выявления спинного мозга.
И, наконец, сделав компрессионную травму. Недавно мы создали неонатальную мышиную модель травмы спинного мозга и продемонстрировали, что неонатальные мыши демонстрируют удивительную степень адаптивной пластичности. Изучение этого механизма, лежащего в основе выздоровления, может дать важные сведения, которые могут быть использованы при лечении травмы спинного мозга.
В этом видео мы покажем, как выполнить компрессионную травму спинного мозга у однодневной мыши. Эта хирургическая процедура включает в себя анестезию, ламинэктомию и две эпидуральные компрессии с зажимом. Подготовка к операции.
Операция проводится под стереомикроскопом. Подложите под микроскоп грелку. Очень важно держать щенка в тепле, чтобы избежать внезапной смерти во время операции.
Положите на грелку хирургическое одеяло или большой лист чистой мягкой лабораторной бумаги. Для предоперационного обезболивания приготовьте инсулиновый шприц, 0,3 миллилитров 30 калибра, заполненный местным анестетиком Маркаином, разведенным стерильным ПБС, до конечной концентрации 2,5 миллиграмма на миллилитр. Для разреза кожи, удаления мышц и ламинэктомии используйте микронож, тонкие щипцы и тонкие ножницы для иридэктомии.
Обратите внимание, что здесь мы также используем щипцы, которые мы согнули на кончиках, чтобы сформировать зубы. Они работают лучше, чем имеющиеся в продаже зубчатые щипцы, потому что зубы должны быть очень маленькими. Для компрессии спинного мозга используйте специально модифицированный миниклипс для временной аневризмы Yasargil, о котором мы расскажем позже.
На небольшой длине пластиковой капиллярной трубки также необходимо сделать пробку, предотвращающую полное закрытие клипсы, и клипс-аппликатор для размещения клипсы. Для наложения швов используйте иглодержатель и маленькие ножницы, чтобы обрезать нить. Для обезболивания разведите Темгезик в стерильном PBS, до 0,03 миллиграмм на миллилитр.
Травма спинного мозга включает в себя компрессию с помощью зажима с использованием миниклипсы для временной аневризмы Yasargil. Перед использованием клипсу необходимо модифицировать механическим способом, обрезав толщину лезвий до 150 микрометров с помощью точильного камня. Непосредственно перед операцией отрежьте короткий отрезок пластиковой трубки и поместите его на одно из лезвий зажима.
Трубка действует как стопор, предотвращая полное закрытие клипсы. Обезболивание и обезболивание. Для газовой анестезии мы используем надпрановый испаритель, подключенный к кислородному баллону.
Изофлуран — это анестетик, который испаряется в чистом кислороде. Чтобы распределить смесь Изофлуран и Кислород мыши, нужно соорудить маску для носа, адаптированную для новорожденных. Неонатальные мыши настолько малы, что маску можно сделать из кончика шприца, который служит входом для пластиковой трубки, подключенной к выходному отверстию испарителя.
Сбоку маски просверлите небольшое отверстие для подключения вакуумной трубки, которая заканчивается либо регулируемым вакуумным насосом, либо узлом сбора, либо просто вытяжным шкафом. Сделайте камеру для перелива анестезии с помощью пластиковой чашки Петри размером 150 на 25 миллилитров. С одной стороны сделайте отверстие, достаточно большое для головы мыши.
С противоположной стороны сделайте два отверстия меньшего размера диаметром с пластиковую трубку. Наконец, сделайте отверстие для эвакуации, меньшее по размеру, чем остальные, в верхней части тарелки. Отрежьте кончик пипетки объемом 250 микролитров и вставьте его в это последнее отверстие.
Наконечник пипетки функционирует как соединитель для вакуумной трубки, которая подключается к вакуумному устройству, настроенному на небольшое отрицательное давление. С помощью пластилина закрепите маску как раз внутри отверстия для головы мыши. С помощью ленты или пластилина закрепите пластиковую трубку к потолку камеры, убедившись, что трубки правильно расположены в соответствующих отверстиях.
Поместите камеру на хирургическое одеяло под микроскоп. Вся система представлена на этой схеме. На выходе испарителя размещен трехсторонний запорный кран.
В этом случае путь к камере сна свободен, в то время как путь к маске заблокирован, и мышь может быть помещена в камеру сна для инициирования седации. Поворот трехстороннего запорного крана вправо позволяет газу поступать к маске и блокирует путь к камере сна. В такой конфигурации мышь может быть перенесена в маску.
Утечки газа удаляются за счет вакуума из переливной камеры. Выберите щенка мыши, который в последнее время пил молоко, о чем свидетельствует белый цвет, видимый сквозь кожу. Поместите щенка в камеру для сна и введите испаренный изофлуран в концентрации 4%, чтобы добиться быстрого успокоения.
Переложите щенка в маску. Осторожно поместите морду мыши хорошо в маску, чтобы обеспечить достаточное воздействие анестезирующего газа. Поверните трехпозиционный запорный кран, чтобы направить газ в сторону маски.
Введите подкожно 50 микролитров Маркаина в концентрации 2,5 миллиграмма на миллилитр в желаемое место операции. Будьте осторожны и не вводите слишком глубоко, так как кровеносные сосуды могут быть легко задеты, и введение маркаина в сосуд смертельно. Сотрите излишки маркаина небольшим стерильным компрессом.
Дорсальная ламинэктомия. Уменьшите концентрацию изофлурана до одного-двух процентов. Через несколько минут проткните кожу микроножом и сделайте отверстие для переноса от восьми до девяти миллиметров, осторожно потянув кожу в ростральном каудальном направлении.
Переносное отверстие намного удобнее и обеспечивает лучший боковой доступ для выполнения ламинэктомии. Отведите края разреза кожи от подлежащих тканей, введя в разрез кусочки спонгистатина, подкожно рострального и каудального. Разрежьте предпозвоночные мышцы тонкими ножницами, чтобы обнажить позвоночник.
Отметим, что у новорожденного спинномозговой процесс развит не до конца. Определите среднюю линию и разрежьте пластинку поперек тонкими ножницами. Следите за тем, чтобы не резать слишком глубоко, так как это может потенциально повредить твердую мозговую оболочку и даже спинной мозг.
Аккуратно поместите одно лезвие тонкого щипца между пластинкой и твердой мозговой оболочкой. Захватите пластинку, закрыв щипцы, и осторожно поднимите ее, пока она не отсоединится, оставив твердую мозговую оболочку в такте. Повторите этот шаг два-три раза, чтобы получить одно-двухсегментную ламинэктомию.
Остановите кровотечение с помощью небольших кусочков спонгистатина. Используя тонкие щипцы в качестве зажимов, удалите части фасеточных суставов с обеих сторон, чтобы получить достаточно места для размещения модифицированного мини-зажима для лечения аневризмы в позвоночном канале. Этот этап часто приводит к кровотечению, которое можно контролировать с помощью небольших кусочков спонгистатина.
Для улучшения видимости иногда имеет преимущество полоскание теплым стерильным PBS, 37 градусов по Цельсию. Создание компрессионной травмы спинного мозга. Откройте зажим и поместите лезвия по обе стороны от спинного мозга в промежутки между фасеточных суставов и спинным мозгом.
Убедитесь, что лезвия введены достаточно глубоко, чтобы охватить вентральную часть спинного мозга. Быстро закройте зажим, удерживая аппликатор на месте, чтобы избежать соскальзывания зажима назад. Через 15 секунд быстро отпустите зажим.
Очистите рану с помощью спонгистатина. Чтобы добиться симметричного сжатия, переверните лопасти и выполните второе сжатие в течение 15 секунд в противоположной ориентации. Наложение швов. Удалите кусочки губкистатина, которые были помещены под кожу в начале операции, и закройте кожу швами 6,0.
Введите 0,05 миллилитра Temgesic в концентрации 0,03 миллиграмма на миллилитр подкожно с помощью инсулинового шприца 30 калибра и поместите щенка в среду с контролируемой температурой при температуре 30 градусов по Цельсию на несколько часов. Чтобы снизить агрессивное поведение матери по отношению к прооперированному щенку в течение первой ночи, после операции приготовьте раствор Диазепама, разведенный в чистом PBS, до 0,1 миллиграмма на миллилитр для внутрибрюшинного введения в дозе восемь граммов на килограмм. Результаты.
Как показано на этом графике, через шесть часов после компрессии спинного мозга на нижних грудных уровнях задние конечности травмированных мышей парализованы, а передние – нет. В случае фиктивных контрольных животных, которым была выполнена только ламинэктомия, обе задние и передние конечности очень подвижны. На участке спинного мозга при виде травмы видна остаточная кровь.
Кроме того, ткань полупрозрачна, что предполагает потерю ткани, что часто приводит к образованию полости через несколько дней. Заключение. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как создать компрессионную травму спинного мозга у неонатальной мыши. Преимущество использования неонатальных мышей заключается в том, что мы можем использовать специальные методы для решения проблемы адаптивной пластичности, которые не могут быть использованы у взрослых мышей.
Кроме того, модель предоставляет платформу для тестирования терапевтических подходов, таких как трансплантация стволовых клеток.
Обзор
В данной статье описывается метод создания воспроизводимого компрессионного повреждения спинного мозга (КПСМ) у новорожденных мышей. Эта модель преимущественна для изучения механизмов адаптивной пластичности, лежащих в основе спонтанного функционального восстановления.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Нейробиология
- Модели повреждений
Теоретические основы
- Травмы спинного мозга могут приводить к значительным функциональным нарушениям.
- Новорожденные мыши обладают удивительной способностью к восстановлению.
- Понимание адаптивной пластичности имеет решающее значение для разработки методов лечения.
- Данная модель позволяет проводить контролируемые эксперименты по травмам спинного мозга.
Цель исследования
- Создать воспроизводимую модель компрессионной травмы спинного мозга.
- Исследовать механизмы восстановления у новорожденных мышей.
- Получить данные для разработки потенциальных терапевтических подходов.
Используемые методы
- Глубокая анестезия новорожденных мышей.
- Дорсальная ламинэктомия для обнажения спинного мозга.
- Компрессионная травма с использованием модифицированного временного микрозажима для аневризм Ясаргиля.
- Послеоперационная анальгезия для купирования боли.
Основные результаты
- Модель успешно индуцирует компрессионную травму спинного мозга.
- У новорожденных мышей после травмы наблюдается значительная адаптивная пластичность.
- Полученные данные могут быть использованы для разработки будущих методов лечения травм спинного мозга.
- Детальный хирургический протокол обеспечивает воспроизводимость модели.
Выводы
- Данная модель является ценным инструментом для изучения травм спинного мозга.
- Понимание механизмов восстановления может привести к созданию более эффективных методов терапии.
- Будущие исследования могут опираться на эту фундаментальную работу.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эта модель компрессии спинного мозга новорожденных мышей позволяет исследовать механизмы адаптивной пластичности при восстановлении после повреждений в раннем возрасте, предоставляя систему, релевантную патологии, для снижения рисков при проверке терапевтических гипотез. Регистрируя динамику спонтанного функционального восстановления, данная модель поддерживает валидацию мишеней и фенотипический скрининг в рамках доклинических программ по нейробиологии. Ее значимость для изучения детских травм спинного мозга и потенциальная трансляционная преемственность в отношении показаний у взрослых улучшают процесс принятия решений на уровне портфеля при разработке нейротерапевтических средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся механизмов адаптивной пластичности при травмах спинного мозга.
- Практическая ценность: Предоставляет биологически релевантную систему для валидации функциональных мишеней с помощью поведенческого и электрофизиологического анализа.
- Прогностическая ценность: Способствует снижению mechanistic-рисков путем установления связи между путями пластичности в раннем возрасте и потенциальными терапевтическими мишенями.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет создавать стандартизированную, воспроизводимую модель повреждения, подходящую для скрининга соединений и тестирования терапевтического вмешательства.
- Количественные показатели: облегчает измерение зависимых переменных, включая подвижность задних конечностей, синаптическую связность и электрофизиологическую активность.
- Масштабируемость: поддерживает высокопроизводительную оптическую запись и физиологический анализ ex vivo для последующей разработки методов анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирование детской травмы спинного мозга с признаками острого нарушения функций задних конечностей и функциональным восстановлением в течение двух недель.
- Трансляционная преемственность: Использование общих механизмов пластичности спинного мозга новорожденных и взрослых для получения данных, применимых к разным возрастным группам.
- Оптимизация разработки с учетом рисков: Возможность оценки терапевтических кандидатов с использованием функционального восстановления и синаптического воссоединения в качестве прогностических биомаркеров.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель вписывается в континуум исследований — от валидации мишени до испытаний доклинической эффективности, особенно применительно к нейропротекторным и нейрорегенеративным подходам.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез об адаптивной пластичности и механизмах функционального восстановления после компрессии спинного мозга.
- Скрининг: Позволяет разрабатывать методы анализа для оценки соединений с использованием количественных поведенческих и физиологических конечных точек.
- Аналитика: Обеспечивает измерение зависимых переменных, таких как электрофизиологические сигналы и оптическая регистрация синаптической связности.
- Трансляционные исследования: Связывает данные о пластичности в раннем возрасте с травмами спинного мозга у взрослых через консервативные биологические механизмы.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для итерационного тестирования терапевтических вмешательств на этапах поиска и доклинических исследований.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность определения мишени за счет выяснения механизмов спонтанного восстановления и адаптивной пластичности.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимую хирургическую модель со стандартизированными параметрами компрессии и послеоперационного ухода.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет получения ранних сигналов об эффективности в модели повреждения с высокой пластичностью.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию нейротерапевтических средств с поправкой на риск на основе показателей функционального восстановления и биомаркеров синаптического восстановления.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с новорожденными мышами, навыки проведения микрохирургических операций и электрофизиологической регистрации.
- Необходима специализированная аппаратура, включая стереомикроскоп, аппликатор для мини-клипс при аневризмах и системы восстановления с контролем температуры.
- Необходима стандартизация действий хирургических бригад для обеспечения единообразия проведения ламинэктомии и нанесения компрессионной травмы.
- Требуется учитывать особенности адаптации при переносе полученных данных с контекста спинного мозга новорожденных на взрослых особей или человека.
- Практические ограничения включают специфичность модели для ранних постнатальных стадий и возможную вариабельность степени тяжести повреждения в зависимости от расположения клипсы.
