Неонатальной спинного мозга мыши Сжатие Травма Модель
27 марта 2016 г.
В этой статье описывается метод создания воспроизводимой компрессионной травмы спинного мозга (ТСМ) у неонатальной мыши. Модель предоставляет благоприятную платформу для изучения механизмов адаптивной пластичности, лежащих в основе спонтанного функционального восстановления.
Общая цель данной процедуры — воспроизводимое моделирование компрессионной травмы спинного мозга у новорожденной мыши. Для этого сначала мышь глубоко анестезируют, после чего выполняют дорсальную ламинэктомию для обнажения спинного мозга.
И, наконец, путем создания компрессионной травмы. Недавно мы создали неонатальную модель повреждения спинного мозга у мышей и продемонстрировали, что новорожденные мыши проявляют удивительную степень адаптивной пластичности. Изучение механизмов, лежащих в основе такого восстановления, может дать важные сведения, которые можно будет использовать при лечении повреждений спинного мозга.
В этом видео мы продемонстрируем, как вызвать компрессионную травму спинного мозга у однодневного мышонка. Данная хирургическая процедура включает анестезию, ламинэктомию и две эпидуральные компрессии с помощью зажимов. Подготовка к операции.
Операция проводится под стереомикроскопом. Поместите под микроскоп грелку. Крайне важно поддерживать тепло тела щенка, чтобы избежать его внезапной смерти во время операции.
Положите хирургическое одеяло или большой лист чистой мягкой лабораторной бумаги на грелку. Для предоперационной анальгезии подготовьте инсулиновый шприц объемом 0,3 мл с иглой 30G, заполненный местным анестетиком Marcaine, разведенным стерильным PBS до конечной концентрации 2,5 mg/ml. Для разреза кожи, удаления мышц и ламинэктомии используйте микроскальпель, тонкий пинцет и тонкие ножницы для иридэктомии.
Обратите внимание, что здесь мы также используем пинцет, кончики которого мы согнули, чтобы сформировать зубцы. Он работает лучше, чем имеющиеся в продаже зубчатые пинцеты, поскольку зубцы должны быть очень маленькими. Для компрессии спинного мозга используйте специально модифицированный временный микроклипс Ясаргиля для аневризм, который мы опишем далее.
Также потребуется небольшой отрезок пластиковой капиллярной трубки для изготовления пробки, предотвращающей полное закрытие зажима, и аппликатор для установки зажима. Для наложения швов используйте иглодержатель и маленькие ножницы для обрезания нити. Для обезболивания разведите Temgesic в стерильном PBS до концентрации 0.03 mg/mL.
Травма спинного мозга наносится путем компрессии с помощью зажима, используя временный микроклипс для аневризмы Yasargil. Перед использованием зажим необходимо модифицировать механически, уменьшив толщину браншей до 150 micrometers с помощью точильного камня. Непосредственно перед операцией отрежьте короткий отрезок пластиковой трубки и наденьте его на одну из браншей зажима.
Трубка служит ограничителем, предотвращающим полное закрытие зажима. Анестезия и анальгезия. Для газового наркоза мы используем испаритель, подключенный к баллону с кислородом.
Изофлуран — это анестетик, который испаряется в чистом кислороде. Для подачи смеси изофлурана и кислорода мыши необходимо изготовить нозовую маску, адаптированную для новорожденных. Новорожденные мыши настолько малы, что маска может быть изготовлена из кончика шприца, который служит входным отверстием для пластиковой трубки, подключенной к выходу испарителя.
В боковой части маски просверлите небольшое отверстие для подключения эвакуационной трубки, которая должна быть подключена либо к регулируемому вакуумному насосу с приемным устройством, либо просто выведена в вытяжной шкаф. Изготовьте камеру для избытка анестетика, используя пластиковую чашку Петри объемом 150 на 25 мл. С одной стороны сделайте отверстие, достаточное по размеру для головы мыши.
На противоположной стороне сделайте два отверстия меньшего размера, равных диаметру пластиковой трубки. Наконец, сделайте эвакуационное отверстие, меньшее остальных, в верхней части чашки. Отрежьте кончик наконечника дозатора на 250 µL и вставьте его в это последнее отверстие.
Наконечник пипетки служит соединителем для эвакуационной трубки, которая подключена к вакуумному устройству, настроенному на создание небольшого отрицательного давления. С помощью пластилина закрепите маску непосредственно внутри отверстия для головы мыши. С помощью скотча или пластилина закрепите пластиковые трубки на потолке камеры, убедившись, что трубки правильно расположены в соответствующих отверстиях.
Поместите камеру на хирургическую пеленку под микроскопом. Вся система представлена на данной схеме. На выходе из испарителя установлен трехходовой кран.
В данном положении путь в камеру для засыпания открыт, тогда как путь к маске перекрыт, что позволяет поместить мышь в камеру для начала седации. Поворот трехходового крана вправо направляет поток газа к маске и перекрывает путь в камеру для засыпания. В этой конфигурации мышь можно перенести к маске.
Газ удаляется из переливной камеры с помощью вакуумного насоса. Выберите детеныша мыши, который недавно пил молоко, о чем свидетельствует белый цвет, видимый через кожу. Поместите детеныша в камеру для сна и введите паров Isoflurane в концентрации 4% для быстрого достижения седации.
Переместите детеныша под маску. Осторожно расположите нос мыши глубоко в маске, чтобы обеспечить достаточное воздействие анестезирующего газа. Поверните трехходовой кран, чтобы направить поток газа в сторону маски.
Введите подкожно 50 µL Marcaine в концентрации 2,5 mg/mL в предполагаемом месте проведения операции. Будьте осторожны, чтобы не ввести препарат слишком глубоко, так как можно легко задеть кровеносные сосуды, а попадание Marcaine в сосуд летально. Промокните излишки Marcaine небольшим стерильным компрессом.
Дорсальная ламинэктомия. Снизьте концентрацию изофлурана до одного-двух процентов. Через несколько минут проколите кожу микроножом и сделайте поперечный разрез длиной восемь-девять миллиметров, осторожно оттягивая кожу в рострально-каудальном направлении.
Трансферный разрез гораздо удобнее и обеспечивает лучший латеральный доступ для выполнения ламинэктомии. Отодвиньте края кожного разреза от подлежащих тканей, вставив кусочки спонгистатина в подкожное пространство ростральнее и каудальнее разреза. Разрежьте превертебральные мышцы тонкими ножницами, чтобы обнажить позвоночник.
Обратите внимание, что у новорожденных спинномозговые отростки развиты не полностью. Определите срединную линию и сделайте поперечный разрез дуги позвонка тонкими ножницами. Следите за тем, чтобы не сделать слишком глубокий разрез, так как это может привести к повреждению твердой мозговой оболочки и даже спинного мозга.
Осторожно поместите одну браншу тонкого пинцета между дужкой и твердой мозговой оболочкой. Захватите дужку, сжимая пинцет, и аккуратно приподнимите ее до полного отделения, чтобы твердая мозговая оболочка осталась неповрежденной. Повторите этот шаг два или три раза, чтобы выполнить ламинэктомию в пределах одного-двух сегментов.
Остановите кровотечение, используя небольшие кусочки спонгистатина. Используя тонкий пинцет в качестве кусачек, удалите части фасеточных суставов с обеих сторон, чтобы создать достаточное пространство для размещения модифицированного микроклипса для аневризмы внутри позвоночного канала. Этот этап часто приводит к кровотечению, которое можно контролировать с помощью небольших кусочков спонгистатина.
Для улучшения видимости иногда полезно промыть область теплым стерильным PBS при температуре 37 °C. Моделирование компрессионной травмы спинного мозга. Раскройте зажим и поместите бранши по обе стороны спинного мозга в пространствах между фасеточными суставами и спинным мозгом.
Убедитесь, что лезвия введены достаточно глубоко, чтобы охватить вентральную часть спинного мозга. Быстро закройте зажим, удерживая аппликатор на месте, чтобы зажим не соскользнул назад. Через 15 секунд быстро откройте зажим.
Очистите рану, используя спонгистатин. Для достижения симметричного сжатия разверните лезвия и проведите повторное сжатие в течение 15 секунд в противоположной ориентации. Наложение швов. Удалите фрагменты спонгистатина, которые были помещены под кожу в начале операции, и зашейте кожу швами 6.0.
Введите подкожно 0,05 мл препарата Temgesic в концентрации 0,03 мг/мл с помощью инсулинового шприца 30G, затем поместите детеныша в среду с контролируемой температурой 30 °C на несколько часов. Чтобы снизить агрессивное поведение матери по отношению к прооперированному детенышу в первую ночь после операции, приготовьте раствор Diazepam, разведенный в чистом PBS, до концентрации 0,1 мг/мл для внутрибрюшинного введения в дозе 8 г/кг.Результаты.
Как видно из этого графика, через шесть часов после компрессии спинного мозга на нижних грудном уровнях задние конечности поврежденных мышей парализованы, в то время как передние конечности — нет. В случае животных контрольной группы (ложная операция), которым была проведена только ламинэктомия, задние и передние конечности обладают высокой подвижностью. На срезе спинного мозга в месте повреждения видны остатки крови.
Кроме того, ткань становится полупрозрачной, что указывает на потерю ткани, которая часто приводит к образованию полости через несколько дней.Заключение. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как вызвать компрессионную травму спинного мозга у новорожденной мыши. Преимущество использования новорожденных мышей заключается в возможности применять специфические методы изучения адаптивной пластичности, которые нельзя использовать у взрослых мышей.
Кроме того, данная модель служит платформой для тестирования терапевтических подходов, таких как трансплантация стволовых клеток.
Обзор
В данной статье описывается метод создания воспроизводимого компрессионного повреждения спинного мозга (КПСМ) у новорожденных мышей. Эта модель преимущественна для изучения механизмов адаптивной пластичности, лежащих в основе спонтанного функционального восстановления.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Нейробиология
- Модели повреждений
Теоретические основы
- Травмы спинного мозга могут приводить к значительным функциональным нарушениям.
- Новорожденные мыши обладают удивительной способностью к восстановлению.
- Понимание адаптивной пластичности имеет решающее значение для разработки методов лечения.
- Данная модель позволяет проводить контролируемые эксперименты по травмам спинного мозга.
Цель исследования
- Создать воспроизводимую модель компрессионной травмы спинного мозга.
- Исследовать механизмы восстановления у новорожденных мышей.
- Получить данные для разработки потенциальных терапевтических подходов.
Используемые методы
- Глубокая анестезия новорожденных мышей.
- Дорсальная ламинэктомия для обнажения спинного мозга.
- Компрессионная травма с использованием модифицированного временного микрозажима для аневризм Ясаргиля.
- Послеоперационная анальгезия для купирования боли.
Основные результаты
- Модель успешно индуцирует компрессионную травму спинного мозга.
- У новорожденных мышей после травмы наблюдается значительная адаптивная пластичность.
- Полученные данные могут быть использованы для разработки будущих методов лечения травм спинного мозга.
- Детальный хирургический протокол обеспечивает воспроизводимость модели.
Выводы
- Данная модель является ценным инструментом для изучения травм спинного мозга.
- Понимание механизмов восстановления может привести к созданию более эффективных методов терапии.
- Будущие исследования могут опираться на эту фундаментальную работу.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эта модель компрессии спинного мозга новорожденных мышей позволяет исследовать механизмы адаптивной пластичности при восстановлении после повреждений в раннем возрасте, предоставляя систему, релевантную патологии, для снижения рисков при проверке терапевтических гипотез. Регистрируя динамику спонтанного функционального восстановления, данная модель поддерживает валидацию мишеней и фенотипический скрининг в рамках доклинических программ по нейробиологии. Ее значимость для изучения детских травм спинного мозга и потенциальная трансляционная преемственность в отношении показаний у взрослых улучшают процесс принятия решений на уровне портфеля при разработке нейротерапевтических средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся механизмов адаптивной пластичности при травмах спинного мозга.
- Практическая ценность: Предоставляет биологически релевантную систему для валидации функциональных мишеней с помощью поведенческого и электрофизиологического анализа.
- Прогностическая ценность: Способствует снижению mechanistic-рисков путем установления связи между путями пластичности в раннем возрасте и потенциальными терапевтическими мишенями.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет создавать стандартизированную, воспроизводимую модель повреждения, подходящую для скрининга соединений и тестирования терапевтического вмешательства.
- Количественные показатели: облегчает измерение зависимых переменных, включая подвижность задних конечностей, синаптическую связность и электрофизиологическую активность.
- Масштабируемость: поддерживает высокопроизводительную оптическую запись и физиологический анализ ex vivo для последующей разработки методов анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирование детской травмы спинного мозга с признаками острого нарушения функций задних конечностей и функциональным восстановлением в течение двух недель.
- Трансляционная преемственность: Использование общих механизмов пластичности спинного мозга новорожденных и взрослых для получения данных, применимых к разным возрастным группам.
- Оптимизация разработки с учетом рисков: Возможность оценки терапевтических кандидатов с использованием функционального восстановления и синаптического воссоединения в качестве прогностических биомаркеров.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель вписывается в континуум исследований — от валидации мишени до испытаний доклинической эффективности, особенно применительно к нейропротекторным и нейрорегенеративным подходам.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез об адаптивной пластичности и механизмах функционального восстановления после компрессии спинного мозга.
- Скрининг: Позволяет разрабатывать методы анализа для оценки соединений с использованием количественных поведенческих и физиологических конечных точек.
- Аналитика: Обеспечивает измерение зависимых переменных, таких как электрофизиологические сигналы и оптическая регистрация синаптической связности.
- Трансляционные исследования: Связывает данные о пластичности в раннем возрасте с травмами спинного мозга у взрослых через консервативные биологические механизмы.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для итерационного тестирования терапевтических вмешательств на этапах поиска и доклинических исследований.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность определения мишени за счет выяснения механизмов спонтанного восстановления и адаптивной пластичности.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимую хирургическую модель со стандартизированными параметрами компрессии и послеоперационного ухода.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет получения ранних сигналов об эффективности в модели повреждения с высокой пластичностью.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию нейротерапевтических средств с поправкой на риск на основе показателей функционального восстановления и биомаркеров синаптического восстановления.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с новорожденными мышами, навыки проведения микрохирургических операций и электрофизиологической регистрации.
- Необходима специализированная аппаратура, включая стереомикроскоп, аппликатор для мини-клипс при аневризмах и системы восстановления с контролем температуры.
- Необходима стандартизация действий хирургических бригад для обеспечения единообразия проведения ламинэктомии и нанесения компрессионной травмы.
- Требуется учитывать особенности адаптации при переносе полученных данных с контекста спинного мозга новорожденных на взрослых особей или человека.
- Практические ограничения включают специфичность модели для ранних постнатальных стадий и возможную вариабельность степени тяжести повреждения в зависимости от расположения клипсы.
