Модель мышь для лазерно-индуцированной неоваскуляризации хориоидеи
27 декабря 2015 г.
Здесь мы представляем протокол лазерно-индуцированной хориоидальной неоваскуляризации (CNV) у мышей, экспериментальную модель, которая воссоздает сосудистые признаки неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации (ВМД). После освоения он может надежно и эффективно индуцировать CNV в качестве модельной системы для тестирования различных экспериментальных мер.
Общая цель этой процедуры заключается в воссоздании признаков неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации или МД на простой для изучения животной модели. Этот метод может быть использован для изучения различных аспектов исследований неоваскулярных исследований МД, в том числе того, как генетические изменения или фармацевтическое лечение могут повлиять на заболевание или как болезнь может проявляться при различных методах визуализации. Основное преимущество этой техники заключается в том, что после освоения ее легко воспроизвести, что позволяет проводить эксперименты быстро и эффективно.
Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что им не хватает тонкой ловкости и координации, чтобы добиться успеха, и то, и другое улучшается с практикой. Чтобы подготовить положение лазерной станции, лазер и щелевая лампа там, где она может быть легко доступна, включают лазер и устанавливают его на заданные параметры. Здесь используются настройки 75 микрометров, размер пятна, мощность 100 милливатт и продолжительность 100 миллисекунд.
Далее поместите анестезию животного на согревание тканей, салфетки и глазные капли с легкой досягаемостью лазерного оператора. После обезболивания первой мыши поместите ее на грелку для животного примерно на три-пять минут. Выполните щипление пальцев ног, чтобы обеспечить полную анестезию.
Затем с помощью скрученной салфетки предотвратить назальную аспирацию жидкости. Поместите по 30 микролитров капли гидрохлорида тетракаина в каждый глаз. Подождите две минуты, пока раствор подействует.
Затем нанесите по одной капле местного тропического средства на каждый глаз, чтобы расширить зрачки. И подождите две минуты, пока раствор подействует. Теперь быстро поместите мышь на рабочую поверхность мыши, а затем установите рабочую область на подбородочную часть щелевой лампы.
Включите щелевую лампу и отрегулируйте ее на самую низкую яркость света. Оцените расширение зрачка мыши. Если зрачок не достиг расширения на 2,5 – три миллиметра.
Верните мышь в согревание животного или введите дополнительную каплю Tropic Aide после расширения зрачка. Ориентируйте мышь на платформе так, чтобы она лежала горизонтально перпендикулярно щелевой балке. Слегка поверните мышь так, чтобы она не находилась под углом примерно 170 градусов.
Расположив голову ближе к оператору лазера, расположите мышь как можно ближе к щелевой лампе, сохраняя при этом устойчивость платформы и оставляя достаточно места для выполнения мелких моторных манипуляций. После того, как мышь будет правильно установлена, нанесите одну каплю раствора искусственной слезы на стеклянную крышку размером 25 на 25 миллиметров. Кроме того, нанесите одну каплю этого раствора на нецелевой глаз мыши, чтобы предотвратить обезвоживание.
Возьмитесь за один угол крышки, проденьте его между большим и указательным пальцами, а оставшиеся три пальца обхватите мышь, чтобы поддерживать и стабилизировать как животное, так и руку оператора. Затем осторожно нажмите на крышку. Наденьте на глаз мыши, чтобы сделать роговицу плоской.
Расположите защитный колышек перпендикулярно траектории лазерного луча, чтобы предотвратить рассеивание или отражение луча. Глядя через щелевую лампу, свободной рукой отрегулируйте фокус до тех пор, пока сетчатка не появится в поле зрения. Сетчатка должна казаться от светло-желтого до красного цвета, с отчетливыми красными кровеносными сосудами, медленно и осторожно двигайте головой мыши или покровом, пока не будет замечен зрительный нерв.
Зрительный нерв будет желтого цвета с множеством кровеносных сосудов, отходящих от него. Затем включите лазерный фокусирующий луч и маневрируйте им, чтобы сфокусироваться на пигментном эпителии сетчатки или РПЭ глазного дна. Если фокусирующий луч кажется овальным или не в фокусе, отрегулируйте фокусировку щелевой лампы или скольжение крышки.
Когда фокусирующий луч правильно отрегулирован, используйте ножной триггер для запуска лазера. Пузырь должен образоваться сразу после введения лазера Поражения с туманными границами или глаза с кровоизлияниями должны быть исключены из анализа. Обязательно наблюдайте образование пузырьков и четкую резко очерченную круглую область, указывающую на сфокусированный лазерный ожог.
Поражения, которые не образуют пузырь, могут не вызывать ХНВ должным образом. Создать дополнительные очаги поражения во всех желаемых положениях хориоидальной неоваскуляризации или ХНВ. Переключите лазер в режим ожидания, когда он не используется, записывайте в лабораторный ноутбук местоположение и результат каждого введения лазера.
Повторите лазерное введение для второго глаза мыши, используя свежий покровный лист и противоположную руку для стабилизации мыши. Выполнив все введения, выключите лазер и щелевую лампу, выбросьте крышку и поместите мышь на животное. Теплее макроскопически.
Осмотрите глаз на предмет любой поверхности роговицы или травмы катаракты. После восстановления верните мышь в клетку. Количественная оценка CNV с помощью анализа плоских сосудистых оболочков после иммунофлуоресцентного окрашивания здесь.
Мечение fit c dextran проводилось с помощью перфузии непосредственно перед жертвоприношением животных. За этим последовала количественная оценка площади с помощью порогового значения на изображении J. Здесь посмертное иммуноокрашивание маркером эндотелиальных клеток. Был проведен селектин ISO GS IB 4 с последующей визуализацией с помощью конфокальной микроскопии.
Были созданы 3D-реконструкции поражения CNV на FOSS и вид сбоку. Оптическая когерентная томография также использовалась для визуализации поражений CNV in vivo. Здесь показано изображение поперечного сечения сетчатки с поражением CNV, обведенным желтым цветом.
Также показано изображение поражения в формате en FOSS, обведенное желтым цветом. После освоения этой техники ее можно сделать за 10 минут, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно убедиться, что животное правильно обезболито, и расположить руки так, чтобы они поддерживались и устойчивы.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как обеспечить концентрацию. Лазерные ожоги вызывают CNV, которые впоследствии могут быть изучены различными способами.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол индуцирования хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ) у мышей, имитирующий сосудистые характеристики неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации (ВМД). Метод разработан таким образом, чтобы обеспечить воспроизводимость и эффективность при проведении различных экспериментальных исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Офтальмология
- Экспериментальные модели
Теоретические основы
- Неоваскулярная форма ВМД является основной причиной потери зрения.
- Животные модели необходимы для изучения механизмов заболевания.
- Модель ХСН позволяет тестировать генетические и фармацевтические вмешательства.
- Развитая мелкая моторика имеет решающее значение для успешного выполнения данного протокола.
Цель исследования
- Воссоздать характерные признаки неоваскулярной ВМД на мышиной модели.
- Облегчить исследование воздействия методов лечения и генетических факторов.
- Предоставить надежный метод изучения прогрессирования заболевания.
Используемые методы
- Подготовка лазерной установки с заданными параметрами.
- Использование лазера и щелевой лампы для индукции ХНВ.
- Мониторинг индуцированной неоваскуляризации.
- Оценка воспроизводимости и эффективности модели.
Основные результаты
- Данный протокол эффективно индуцирует ХНВ у мышей.
- После освоения метод позволяет проводить эксперименты в ускоренном темпе.
- Отмечается вариативность показателей успеха среди неопытных пользователей.
- Данная модель может быть использована для изучения различных направлений исследований ВМД.
Выводы
- Модель ХНВ у мышей является ценным инструментом для исследования ВМД.
- Освоение данной методики необходимо для получения воспроизводимых результатов.
- Этот метод может способствовать более глубокому пониманию ВМД и поиску потенциальных способов лечения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Мышиная модель хориоидальной неоваскуляризации (ХНВ), индуцированной лазером, представляет собой воспроизводимую и экономически эффективную систему для изучения неоваскулярной формы возрастной макулярной дегенерации (ВМД), позволяющую проводить экспресс-оценку генетических и фармакологических вмешательств. Ее ценность заключается в моделировании ангиогенных путей, необходимых для валидации мишеней и снижения доклинических рисков при разработке офтальмологических препаратов. Данная модель поддерживает проведение механистических исследований и терапевтического скрининга, обеспечивая трансляционную преемственность от этапа поиска до оптимизации ведущих соединений.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать ангиогенные пути и молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования ХСНВ.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней с помощью генетических манипуляций и фенотипического анализа.
- Стратегическая ценность: способствует проверке гипотез и снижению биологических рисков при изучении мишеней, участвующих в сосудистой дисрегуляции.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет создавать количественно оцениваемые очаги ХНВ с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания и пороговой обработки в ImageJ для анализа зависимости «доза — ответ».
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизированную индукцию очагов с воспроизводимыми параметрами лазера (размер пятна 75 µm, мощность 100 mW, длительность 100 ms).
- Стратегическая ценность: Позволяет проводить высокопроизводительную оценку влияния соединений на сосудистую утечку и неоваскуляризацию.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирование патологического ангиогенеза для оценки терапевтической эффективности в живой системе.
- Практическая ценность: Совместимость с такими методами визуализации, как оптическая когерентная томография (OCT) и конфокальная микроскопия, для лонгитюдного мониторинга.
- Стратегическая ценность: Обоснование принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет установления связи между модуляцией мишени и фенотипическими исходами в доклинической модели ВМД.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель вписывается в континуум поиска лекарственных средств — от идентификации мишени до оптимизации соединений-лидеров, обеспечивая фенотипические данные, которые служат основанием для принятия решений о переходе к этапу доклинических исследований.
- Биологические исследования: способствует уточнению сигнальных путей и валидации мишеней посредством индуцированного формирования CNV у мышей дикого типа и трансгенных мышей.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные, количественно определяемые показатели ангиогенеза, подходящие для скрининга библиотек соединений.
- Аналитика: позволяет проводить количественную оценку площади поражения и 3D-реконструкцию для сравнительного анализа различных экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: связывает молекулярные вмешательства с сосудистой патологией, обеспечивая доклиническую оценку на основе биомаркеров.
- Повторное использование в организации: создает многоразовую платформу для итерационного тестирования генетических и фармакологических модификаторов CNV.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в связывании с мишенью путем моделирования ангиогенных ответов in vivo.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость и масштабируемость после достижения технического мастерства, что снижает вариабельность экспериментов.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя осуществлять быстрые итерации и раннее выявление неудач в программах по изучению ВМД.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе их модулирующего воздействия на фенотипы ХНВ.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области микрохирургии, лазерного воздействия на ткани и визуализации сетчатки под контролем щелевой лампы.
- Результат зависит от точной калибровки лазера и стабильного позиционирования животного для обеспечения однообразного формирования повреждений.
- Необходима стандартизация действий всех операторов для минимизации вариабельности при индукции и количественной оценке ХНВ.
- При адаптации метода следует учитывать трансгенный фон и альтернативные конечные точки визуализации для анализа специфических сигнальных путей.
- Практические ограничения включают острый, индуцированный травмой характер ангиогенеза, который может не полностью воспроизводить патофизиологию хронической ВМД.
