Сравнительный анализ человеческого гормона роста в сыворотке, используя SPRI, Nano-SPRI и ELISA Анализы

Общая цель данного исследования заключается в оценке диагностического потенциала прямого и усиленного метода визуализации поверхностного плазмонного резонанса (SPRi-анализа) для обнаружения биомаркеров в сыворотке крови, а также в его прямом сравнении с коммерчески доступным набором для иммуноферментного анализа (ELISA). Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биомедицины, такие как выявление болезни на ранней стадии и обеспечение средств мониторинга терапевтической эффективности. Основным преимуществом SPRi является возможность безмаркерного мониторинга и визуализации биомолекулярных взаимодействий в режиме реального времени путем регистрации изменений показателя преломления среды вблизи поверхности сенсора.

Применение этого метода распространяется на диагностику уровней hGH в сыворотке крови, поскольку эндогенный hGH связан с многочисленными медицинскими расстройствами, влияющими на рост и развитие человека. Визуальная демонстрация данного метода имеет решающее значение, так как этапы подготовки химии поверхности биочипа трудно освоить, и любая ошибка может существенно повлиять на результаты. После приготовления растворов и образцов белков согласно текстовому протоколу используйте 120 milliliters стабилизированного раствора «пиранья» для очистки золотого чипа с помощью соникации при 50 °C в течение 90 минут.

Промойте чип водой, затем подвергните воздействию ультразвука в воде в течение пяти минут. После этого промойте чип этанолом и высушите его струей азота. Поместите золотой чип в камеру с УФ-озоном на 30 минут для удаления загрязнений.

Затем добавьте 150 milligrams 11-меркаптоундекановой кислоты в 20 milliliters этанола в пробирку с пластиковой крышкой для фиксации чипа и магнитным якорем для гомогенного перемешивания раствора. Поместите чип в пробирку и закройте ее крышкой. Затем подвергните содержимое пробирки микроволновому воздействию при мощности 50 watts и температуре 50 °C в течение пяти минут.

Промойте чип этанолом, затем выдержите его в этаноле в течение пяти минут. Повторите промывку водой и снова выдержите в течение пяти минут. Добавьте 150 mg 1-этил-3-карбодиимида в 20 mL воды в пробирку с магнитным перемешивателем.

Перенесите чип в пробирку и обработайте в микроволновой печи, как было показано ранее. Промойте чип водой и оставьте его замачиваться в воде на пять минут. Затем добавьте 150 milligrams N-Hydroxysuccinimide к 20 milliliters воды в пробирку с магнитным перемешивателем.

Поместите чип в пробирку, закройте её крышкой и обработайте в микроволновой печи. После промывки и вымачивания чипа в воде, как описано ранее, добавьте 250 мкМ полиэтиленгликоля в 20 мл воды в пробирку с перемешивающим элементом. Добавьте чип и обработайте в микроволновой печи, затем промойте и вымочите в воде, как и в предыдущем случае.

Приготовьте раствор антител к rhGH в концентрации 15 µg/mL, а также анти-IgG в качестве отрицательного контроля, и внесите по 10 µL каждого раствора в отдельные лунки планшета на 384 лунки. Настройте схему нанесения в микроматрицере и с помощью тефлонового пина диаметром 500 µm нанесите антитела на чип. Инкубируйте чип с нанесенными образцами при комнатной температуре и влажности 75% в течение двух часов.

После подготовки эксперимента SPRi и блокировки чипа согласно текстовому протоколу, приготовьте раствор rhGH со следующим набором концентраций в PBS, содержащем 10% сыворотки и один миллиграмм на миллилитр BSA. Важно подчеркнуть выбор типа блокирующей молекулы на этом этапе, так как целью является минимизация неспецифических взаимодействий.

Приготовьте раствор в соотношении два к одному, добавив 1 µL антител для детекции anti-rhGH, меченных биотином (концентрация 6 µM), к 3 µL ближних инфракрасных квантовых точек, покрытых стрептавидином (концентрация 1 µM), в микроцентрифужной пробирке объемом 0.5 mL. Введите 150 µL раствора сыворотки крови человека с добавлением hGH в инжекционную петлю. За резким увеличением сигнала последует медленное снижение по мере смыва неспецифически связавшейся сыворотки с поверхности.

После стабилизации сигнала промойте поверхность раствором NaCl с концентрацией 450 millimolar, добавленным в бегущий буфер. Разведите раствор детектирующих антител к anti-rhGH и квантовых точек бегущим буфером до концентрации 10 nanomolar и введите в проточную кювету. Импортируйте полученные данные в программу для анализа данных.

Затем постройте график зависимости сигнала SPRi от времени и определите разницу между пятнами антител к anti-rhGH и отрицательным контролем после промывки высокосолевым раствором. Для проведения ELISA, после подготовки реагентов, лунок, покрытых антителами, и стандартов согласно текстовому протоколу, приготовьте образцы гормона rhGH в 10% сыворотке человека в следующих концентрациях. Добавьте 50 µL каждого стандарта, контроля и образца в каждую лунку в трех повторах.

Затем закройте лунки и инкубируйте при температуре четыре градуса Цельсия при осторожном встряхивании в течение ночи. На следующий день извлеките планшет из шейкера и дайте ему прогреться до комнатной температуры. Доведите анти-rhGH HRP, конъюгирующий буфер, промывочный буфер, хромоген тетраметилбензидин (TMB) и стоп-реагент до комнатной температуры.

Для приготовления рабочих реагентов разведите анти-rhGH HRP конъюгат в конъюгационном буфере в 40 раз. Разведите промывочный буфер дистиллированной водой в 200 раз. Добавьте по 50 µL конъюгата anti-rhGH HRP в каждую лунку.

Запечатайте лунки и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут при осторожном встряхивании. Слейте раствор из лунок, переверните планшет и промокните его на абсорбирующей салфетке досуха. Добавьте по 200 µL промывочного буфера в каждую лунку, после чего снова слейте жидкость и промокните планшет досуха.

Повторите промывку трижды. Важно постучать по 96-луночной планшету, чтобы удалить остатки реагентов, так как использование только пипетки недостаточно эффективно. Затем в каждую лунку добавьте 100 µL хромогена в течение 15 минут после этапа промывки.

Инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут при осторожном перемешивании. Бесцветные растворы окрасятся в синий цвет. Добавьте по 100 µL стоп-реагента в каждую лунку.

Растворы изменят цвет с синего на желтый. Используйте планшетный ридер при 450 нанометрах, чтобы немедленно измерить оптическую плотность в каждой лунке. В завершение постройте калибровочную кривую для предоставленных стандартов, а затем постройте график зависимости оптической плотности rhGH в образцах 10% сыворотки от концентрации каждого образца.

В данном видео сравнивалась эффективность SPRi и nano-SPRi с методом ELISA для детекции rhGH. На этом рисунке представлена кривая титрования rhGH, добавленного в 10% сыворотку крови человека, в зависимости от полученного значения OD при 450 нанометрах. Наблюдался хороший линейный отклик, а предел обнаружения составил один нанограмм на миллилитр.

В данном случае определение rhGH проводили с помощью SPRi. Каждая точка на кривой градиента концентрации представляет собой среднее значение разности коэффициентов отражения, рассчитанное по трем кинетическим кривым SPRi для каждой концентрации. Предел обнаружения, или LoD, составил 3,61 nanograms per milliliter.

Для повышения чувствительности биосенсора SPRi на сенсор последовательно вводили наноусилители. В данном эксперименте наноусилители увеличили отклик биосенсора до 7,9%, при этом минимальное изменение сигнала наблюдалось в контроле. Практическая применимость нано-SPRi биосенсора была оценена путем измерения концентрации rhGH в диапазоне от 30 000 до 0,25 пг/мл.

Предел обнаружения (LoD) составил 9,2 пг/мл, а коэффициент вариации — 20%. После освоения данной методики время проведения прямого детектирования сокращается до одного часа, а nano-SPRi — до двух часов, при условии правильного выполнения всех этапов. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости оптимизации условий для каждого шага; после этого результаты можно будет легко воспроизвести за более короткий промежуток времени. После завершения этой процедуры на чипе можно провести другие методы анализа, такие как multi-tuff или maspeck, непосредственно после эксперимента SPRi, чтобы получить дополнительные сведения о захваченной молекуле.

После разработки эта методика должна открыть исследователям в области медицинской диагностики путь к одновременному определению нескольких биомаркеров, связанных с онкологическими, неврологическими и сердечно-сосудистыми заболеваниями. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить анализ SPRi, nano-SPRi и ELISA для определения уровней hGH в сыворотке крови человека. Не забывайте, что работа с реагентами может быть крайне опасной, поэтому при выполнении этой процедуры необходимо всегда соблюдать меры предосторожности, такие как использование перчаток и защитных очков.