Стратегия для обоснования роли каллозы опосредованной Plasmodesmal воротного в Tropic Response

Общей целью этой процедуры является скрининг генов, участвующих в каллозно-опосредованном плазмодесмальном гейтировании во время тропного ответа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития растений, например, какие неизвестные гены контролируют межклеточную передачу сигналов плазмодесматами во время тропического ответа. Главное преимущество этой методики в том, что она проста, работает тоже, и повторяется.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что работа с этиолированными гипокотилами Arabidopsis без каких-либо повреждений в течение всего процесса является сложной задачей. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы устанавливали правило GSL8, глюкозосинтазы в плазмодезмальном гейтинге. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку процедуры, упомянутые в аудио, не объясняют критические шаги, которые трудно выполнить, потому что они требуют специальной настройки и обработки.

Приготовьте Мурасиге и Скуг, или среду МС, за сутки до эксперимента. Автоклавируйте его, и заполните 125-миллиметровые квадратные пластины 50 миллилитровыми средами на каждую пластину. На следующий день разложите по полувысушенным тарелкам семена, стерилизованные 1,1%-ным гипохлоритом натрия.

С 1-миллиметрового кончика микропипетки насыпьте семена 200 микролитрами воды. Разложите семена в пять рядов на расстоянии 1,8 сантиметра друг от друга, при этом семена должны находиться на расстоянии не менее 0,1 сантиметра друг от друга. Дайте воде испариться, прежде чем накрыть и заклеить пластины хирургическим скотчем.

Затем заверните тарелки в фольгу и поместите их в коробку. Выдерживайте коробку при температуре четыре градуса Цельсия в течение трех дней. После трех дней обработки холодом перенесите коробку с семенами в 22 градуса Цельсия на трое суток.

Еще через три дня в темном помещении проверьте состояние всхожести семян под зеленым светом. Обычно трехдневная этиолированная рассада Col-0 вырастает до 1,6 сантиметра в длину. Под зеленым светом проанализируйте измененную фототропную и гравитропную реакцию.

С помощью стерилизованной пикировки отбирайте рассаду одинакового размера с прямым, вертикальным ростом. Аккуратно приподнимите рассаду из самой нижней части гипокотиля, не касаясь других частей. Затем аккуратно переложите выбранную рассаду в свежую агаровую пластину МС.

На новой пластине таким же образом ориентируйте крючки рассады. Выберите не менее 20 саженцев каждого генетического фона, чтобы сделать каждый ряд, и сделайте дубликат каждой пластины. Каждая пластина содержит два генотипа в два ряда.

Чтобы проверить фототропную реакцию, расположите пластины в черном ящике так, чтобы рассада была ориентирована вертикально. Оставьте одну сторону коробки открытой до края тарелок. Затем инкубируйте ящик в камере для выращивания растений с односторонним белым светом.

Чтобы проверить гравитропную реакцию, оберните пластины пленкой и положите в черный ящик так, чтобы рассада располагалась горизонтально. В нескольких временных точках, обычно начиная с 90 минут и заканчивая 12 часами, делайте снимки пластин в условиях низкой освещенности. Используйте сканер для сбора изображений JPEG с разрешением 600 DPI.

Чтобы измерить угол изгиба саженцев, загрузите их изображения в программное обеспечение ImageJ. Используйте инструмент увеличения для увеличения масштаба и прокрутите до саженца для анализа. Затем с помощью инструмента «Угол» измерьте угол, на который изгибается саженец.

Для этого дважды щелкните левой кнопкой мыши по исходной точке направления роста гипокотиля А и перетащите мышь к точке начала изгиба В. Затем используйте щелчок левой кнопкой мыши, чтобы нарисовать первую линию. Теперь перетащите мышь из точки B в точку изгиба, точку C, и используйте левый щелчок, чтобы нарисовать вторую линию, образующую угол A. Истинный угол изгиба — это угол B, который равен 180 градусам минус угол A. Теперь измерьте и запишите угол A, нажав M на клавиатуре. Файл с результатом откроется отдельно.

Повторите предыдущий шаг для измерения остальной части рассады и измерьте средний угол двух разных фонов с помощью файла таблицы набора данных. Приготовление необходимых для этого анализа агарозных блоков HPTS описано в текстовом протоколе. Начните с подготовки образцов растений.

В этом примере анализируются мутанты с измененным пределом исключения размера плазмодесмат. Во-первых, создайте платформу для проведения анализа. Поместите предметное стекло микроскопа на новую пластину MS Medium.

Далее из МС пластин с трехдневной этиолированной рассадой с помощью острых хирургических ножниц аккуратно вырезаем рассаду от основания крючка, и перекладываем их на покровное стекло. Пересаживают не менее пяти саженцев на каждый генетический фон. Ориентируйте рассаду так, чтобы на предметном стекле оставалось всего 0,5 сантиметра гипокотиля от места иссечения, а остальная часть гипокотиля касалась среды.

Затем поместите агарозный блок HPTS поверх вырезанных саженцев так, чтобы иссеченный участок соприкасался с блоком HPTS. Убедитесь, что контакт установлен. Дайте блоку постоять на гипокотилах в течение пяти минут.

Затем переложите гипокотиль в 10-миллиметровую чашку Петри, содержащую воду двойной дистилляции, и промойте их встряхиванием в течение 15 минут. Далее переложите промытую рассаду на горку. Поместите каждого мутанта рядом с контрольной группой, чтобы провести прямое сравнение.

Залейте гипокотиль 100-150 микролитрами дважды дистиллированной воды и накройте крышкой. Теперь проанализируйте предметное стекло с помощью конфокальной микроскопии, как описано в текстовом протоколе. Для этого анализа используйте свежеприготовленный краситель, который был выдержан менее двух дней назад и хранился в темноте.

Чтобы подавить синтез кальлозы de novo, добавьте в краситель 1,5 миллимоляра 2-дезокси-D-глюкозы. Начните этот анализ с выбора трехдневных этиолированных сеянцев для окрашивания каллозой, с тропической реакцией или без нее. Срежьте рассаду из ее крючковой области с помощью тонких хирургических ножниц.

Затем с помощью кончика зубочистки пересадите рассаду в небольшую чашку Петри, содержащую два миллилитра буфера для окрашивания. Инкубируйте рассаду в буфере для окрашивания в темноте в течение двух часов с непрерывным встряхиванием при 30 об/мин. После окрашивания промойте рассаду дважды дистиллированной водой в течение двух минут, чтобы удалить излишки буфера для окрашивания.

После мытья выберите не менее пяти саженцев каждого фона для конфокального анализа. Измерьте интенсивность сигнала каллозы с помощью программного обеспечения ImageJ. Откройте файл конфокальной микроскопии, уже сохраненный в формате JPEG в программном обеспечении для обработки изображений.

Далее, с помощью инструмента прямоугольного выделения, проведите курсором по картинке, и выделите область, которую нужно исследовать. Затем измерьте и запишите числовые значения интенсивности сигнала, нажав M. Файл результатов откроется отдельно. В файле результатов термин «Среднее» указывает на интенсивность сигнала выбранной области, а не на среднее значение нескольких областей.

Один за другим анализируйте сигнал таким образом для каждого саженца. Повторите описанный выше шаг для измерения остальной части рассады и измерьте средний угол двух разных фонов с помощью файла таблицы набора данных. С использованием описанных протоколов были проанализированы индуцируемые дексаметазоном линии РНК-интерференции AtGSL8.

Проростки DsGSL8 имели явные дефекты фототропизма и гравитропизма. Они не проявляли изгиба под действием ни одной из этих сил. Изменения в симплазматическом движении показали, что движение красителя HPTSA было значительно более обширным в нокдауне dsGSL8 RNAi, чем в любом из контрольных групп.

Каллоза является одним из ключевых регуляторов предела исключения размера плазмодесматы, а AtGSL8 является известной плазмодесматной кальлоза-синтазой. Так, было проведено окрашивание каллозным анилиновым синим. В контрольной части каллоза накапливается через шесть часов, что отмечено желтыми стрелками.

Однако через шесть часов у мутантов наблюдался устойчиво низкий уровень каллозы плазмодесмат. Это отсутствие синтеза каллозы было заметно меньше уже через три часа после фототропизма. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить быстрый скрининг генов в вариантах, контролирующих плазмодезмальное гейтирование из-за тропного ответа путем модуляции чисто каллозной.

После освоения этого метода его можно сделать примерно через шесть часов после трехдневного проращивания рассады арабидопсиса. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нельзя повредить рассаду при ее переносе. Кроме того, важно обеспечить надлежащий контакт между агаром и гипокотилом во время анализа нагрузки.

После этого развития этот метод проложил путь в биологию развития к исследованию генов, новых генов, которые играют роль в контроле симплазматической проводимости во время тропика