Функциональная Клонирование Использование Xenopus Ооцитов выражение системы

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать ооцит Xenopus, систему крышек животных, подходящую для идентификации продуктов генов, способных вызывать реакцию у компетентной эктодермы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, например, какие гены необходимы для незаконной индуктивной реакции. Основным преимуществом этого метода является использование ооцита Xenopus в качестве системы экспрессии для производства и идентификации индукторов, действующих на ткань-мишень, или даже генов, действующих выше индукторов.

Визуальная демонстрация этого метода чрезвычайно полезна, так как этапы диссекции и рекомбинации сильно зависят от стадии и требуют отточенной техники. После сбора ткани яичников у самок лягушек, находящихся под наркозом, разорвите ткань на мелкие кусочки, каждая из которых содержит примерно от 10 до 20 ооцитов. И перенесите эти фрагменты, сначала в свежий OR2-раствор, а затем в OR2-содержащий 2,0 миллиграмма на миллилитр коллагеназы А. Продолжайте, аккуратно взбалтывая тканесодержащую смесь на шейкере в течение одного часа.

Затем переложите фрагменты в свежий раствор коллагеназы, и перемешайте в течение дополнительного часа. Ожидайте наблюдения за дефлокуляцией яйцеклеток в конце этого лечения. Приступайте к промывке ооцитов 10 раз в полном OR2, а затем дважды в питательной среде для ооцитов, сокращенно OCM.

После этого поместите ооциты в свежий ОКМ и визуально осмотрите их под микроскопом для вскрытия. Выделите их на шестой стадии, отбросив более мелкие, незрелые ооциты. Затем поместите ооциты в чашку Петри, покрытую агарозой, содержащую OCM, и поддерживайте их при температуре от 18 до 20 градусов Цельсия до инъекции.

Чтобы подготовиться к микроинъекции, поместите стеклянную капиллярную трубку в съемник игл, потяните за нее, а затем отломите кончики от стекла, чтобы получить иглы диаметром примерно 20 микрометров. На составном микроскопе измерьте кончики игл с помощью калиброванного окулярного микрометра. Далее выдавливаем глину равномерным слоем на дно чашки Петри размером 35 на 10 миллиметров.

А затем создайте параллельные углубления в этом слое с помощью инструмента, похожего на щуп. Наполните форму, выстланную глиной, примерно 2 миллилитрами 3% Ficoll в 1x модифицированном физрастворе Барта или MBS. А затем перенести в него ооциты, используя пипетку с широким отверстием.

Расположите ооциты в бороздках таким образом, чтобы они удерживались на месте во время последующей микроинъекции. С помощью микроинъектора заполните иглу примерно двумя микролитрами ранее сгенерированного пула мРНК и отрегулируйте баланс таким образом, чтобы создать небольшое положительное давление, которое предотвратит втягивание цитоплазмы ооцитов в иглу во время инъекции. Затем введите в каждую яйцеклетку 20 нанолитров РНК в экваториальную область.

После этого оставьте ооциты в Ficoll MBS на один час, а затем аккуратно перенесите их в 1x MBS. Продолжайте инкубацию ооцитов в течение восьми-24 часов при температуре 20 градусов Цельсия. Чтобы начать анализ колпачка животного, соберите 3/4-кратную нормальную среду амфибий, сокращенно раствор NAM, тонкие щипцы, петлю для волос, ранее введенные ооциты и эмбрионы ксенопуса на стадии от 11 до 11,5.

Затем разбейте стеклянную крышку на фрагменты размером примерно один миллиметр на два миллиметра и пропустите эти кусочки через пламя, пока их края не будут отполированы и вытянуты. Далее в посуде в один слой прижмите глину, как описано ранее. А с помощью щупа торгового центра создать в этом покрытии индивидуальные чашеобразные оттиски.

Продолжайте наполнять форму примерно двумя миллилитрами 3/4x NAM. И к нему переносят введенные ооциты, располагая несколько так, чтобы каждый был обездвижен в одном углублении. Чтобы подготовить эмбрионы, перенесите их в посуду, содержащую 3/4x раствор NAM.

Выберите подгруппу гаструл, которая будет использоваться в качестве контрольной стадии для определения возраста эктодермы, и перенесите их в другую чашку, содержащую тот же раствор. И отложите эту тарелку в сторону. Для эмбрионов, которые будут использоваться в сборе шапки животного, удалите их вителлиновые оболочки с помощью двух пар тонких щипцов.

После этого переложите гаструлу в выстланную глиной посуду с ооцитами. Для начала срежьте шляпки животных с эмбрионов, используя две пары тонких форцепов, стараясь не затрагивать экваториальную ткань. Чтобы получить рекомбинанты с помощью первого метода, расположите колпачки животного так, чтобы внутренняя поверхность соприкасалась с животным полушарием ооцита, уже расположенным в углублении.

И повторите этот процесс для нескольких введенных ооцитов. Чтобы убедиться, что эти рекомбинанты удерживаются вместе, поместите изогнутый фрагмент стеклянного покровного стекла поверх каждого из них и надавливайте вниз до тех пор, пока животное не расплющится, а покровное стекло не соприкоснется с глиной. Чтобы получить рекомбинанты с помощью второго метода, поместите колпачки животных и ооциты вместе в пустые отдельные углубления в глине.

И убедитесь, что внутренние поверхности колпачков животных обращены к ооциту. Затем закрепите две ткани вместе с помощью небольших наращиваний из глины. После того, как с помощью любого из этих методов было получено несколько рекомбинантов, затем культивирование и отложенные эмбрионы контролируют при температуре 20 градусов Цельсия.

Когда контрольные эмбрионы достигнут нужной стадии, удалите покровные стекла из рекомбинантов и изолируйте эктодерму животного с помощью щипцов и петли для волос. Продолжайте фиксировать оба эктодермальных фрагмента и контролировать эмбрионы в MEMFA в течение одного часа. А затем перевести их в этанол и хранить эту ткань при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

Здесь наборы ооцитов вводили пулы мРНК, соответствующие постепенно уменьшающемуся числу клонов или колоний, а затем культивировали с колпачками животных. Впоследствии было определено количество колпачков животных в каждом наборе, экспрессирующих foxe3, маркер, обычно наблюдаемый в эктодерме предполагаемого хрусталика от ранних стадий нервной пластинки до формирования везикул, и использование здесь для оценки способности индуцировать хрусталик. Этот метод идентифицирован в гене, кодирующем ядерный фактор, ldb1, который может вызывать индуцирующий хрусталик ответ у 50 из 179, или у 28% оцененных животных.

Здесь показаны наши изображения гибридизации in situ, изображающие сигнал foxe3, обозначенный наконечниками стрелок, в колпачках животных, культивированных инъецированными ооцитами ldb1, примерно с 11 по 23 стадию. Экспрессия foxe3 не наблюдается в соответствующих контрольных колпачках животных, размещенных на неинъекционных ооцитах. Когда срезы были получены из этих шапочек животных, экспрессия foxe3 наблюдалась как во внутреннем, так и во внешнем эктодермальном слоях.

Экспрессия во внутреннем слое характерна для отклика объектива. Или, как сигнализируют в обоих слоях, указывает на другие структуры, такие как обонятельный плакод. После этой процедуры могут быть выполнены такие методы, как иммуногистохимия, гибридизация in situ или прямое обнаружение флуоресцентного репортерного гена, чтобы оценить индуктивный ответ в эктодерме животного.