Функциональная Клонирование Использование

Общая цель данной процедуры заключается в демонстрации системы с использованием ооцитов Xenopus и животного полюса эмбриона (animal cap), подходящей для идентификации генных продуктов, способных индуцировать ответ в компетентной эктодерме. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, например, о том, какие гены необходимы для запуска индукционного ответа. Основным преимуществом этой методики является использование ооцитов Xenopus в качестве экспрессионной системы для выработки и идентификации индукторов, воздействующих на таргетную ткань, или даже генов, действующих выше индукторов по сигнальному пути.

Визуальная демонстрация этого метода крайне полезна, так как этапы диссекции и рекомбинации сильно зависят от стадии развития и требуют отточенной техники. После сбора тканей яичников из анестезированных самок лягушек разделите ткань на небольшие фрагменты, содержащие примерно от 10 до 20 ооцитов в каждом. Перенесите эти фрагменты сначала в свежий раствор OR2, а затем в раствор OR2, содержащий 2.0 mg/mL коллагеназы A. Затем осторожно перемешивайте смесь с тканью на шейкере в течение одного часа.

Затем перенесите фрагменты в свежий раствор коллагеназы и перемешивайте в течение еще одного часа. По завершении данной обработки следует наблюдать дефлоккулированные ооциты. Перейдите к промывке ооцитов 10 раз в полном OR2, а затем дважды в среду для культивирования ооцитов, сокращенно OCM.

После этого поместите ооциты в свежую среду OCM и осмотрите их под диссекционным микроскопом. Выделите ооциты на шестой стадии, отсеяв более мелкие, незрелые ооциты. Затем поместите ооциты в чашку Петри с агарозным покрытием, содержащую OCM, и поддерживайте температуру от 18 до 20 °C до момента инъекции.

Для подготовки к микроинъекции поместите стеклянную капиллярную трубку в вытяжку для игл, вытяните её, а затем отломите кончики стекла, чтобы получить иглы диаметром примерно 20 мкм. С помощью сложного микроскопа измерьте кончики игл с помощью откалиброванного окулярного микрометра. Затем распределите глину равномерным слоем по дну чашки Петри размером 35 x 10 мм.

Затем с помощью инструмента, похожего на маленький зонд, сделайте в этом слое параллельные бороздки. Заполните чашку с глиняным дном примерно 2 миллилитрами 3% Ficoll в 1х модифицированном физиологическом растворе Барта (MBS). После этого перенесите в нее ооциты, используя пипетку с широким отверстием.

Расположите ооциты в желобках так, чтобы они были зафиксированы во время последующей микроинъекции. С помощью микроинъектора наполните иглу примерно 2 µL предварительно подготовленного пула мРНК и отрегулируйте баланс для создания небольшого положительного давления, чтобы предотвратить втягивание цитоплазмы ооцита в иглу во время инъекции. Затем введите в экваториальную область каждого ооцита 20 nL РНК.

После этого оставьте ооциты в растворе Ficoll MBS на один час, а затем осторожно перенесите их в 1x MBS. Инкубируйте ооциты от восьми до 24 часов при 20 °C. Для проведения анализа動物-cap (animal cap assay) подготовьте 3/4x нормальную среду для амфибий (сокращенно раствор NAM), тонкий пинцет, волосяную петлю, предварительно инъецированные ооциты и эмбрионы Xenopus стадий 11–11,5.

Затем разбейте стеклянные покровные стекла на фрагменты размером примерно 1 мм на 2 мм и прокалите эти кусочки в пламени до тех пор, пока их края не загладятся и не оплавятся. Далее распределите глину в чашке одним слоем, как описано ранее. С помощью небольшого зонда сделайте в этом покрытии отдельные лункообразные углубления.

Заполните чашку примерно двумя миллилитрами 3/4x NAM. Перенесите в нее инъецированные ооциты, располагая их так, чтобы каждый из них был зафиксирован в отдельном углублении. Для подготовки эмбрионов перенесите их в чашку с раствором 3/4x NAM.

Выберите группу гаструл, которые будут использоваться в качестве контролей стадии для определения возраста эктодермы, и перенесите их в другую чашку с тем же раствором. Отставьте эту пластину в сторону. Для эмбрионов, которые будут использоваться в анализе животных шапочек, удалите вителлинные мембраны с помощью двух пар тонких пинцетов.

После этого перенесите гаструлу в чашку с глиняным дном, в которой находятся ооциты. Для начала отсеките анимальные крышки от эмбрионов, используя два пары тонких пинцетов, стараясь не затрагивать ткани экваториальной зоны. Чтобы создать рекомбинанты первым методом, расположите анимальную крышку так, чтобы её внутренняя поверхность соприкасалась с анимальным полушарием ооцита, который уже помещен в углубление.

Повторите этот процесс для нескольких инъецированных ооцитов. Чтобы обеспечить плотное прилегание рекомбинантов, поместите фрагмент изогнутого стеклянного покровного стекла на каждый из них и надавите до тех пор, пока эмбрион не станет плоским, а покровное стекло не коснется глины. Для создания рекомбинантов вторым методом поместите анимальные шапочки и ооциты вместе в пустые индивидуальные лунки в глине.

Убедитесь, что внутренние поверхности колпачков животных обращены к ооциту. Затем зафиксируйте две ткани вместе, используя небольшие фрагменты глины. После создания нескольких рекомбинант любым из этих методов, культивируйте их вместе с отложенными контрольными эмбрионами при 20 °C.

Когда контрольные эмбрионы достигнут нужной стадии, снимите покровные стекла с рекомбинантов и изолируйте эктодерму животного полюса с помощью пинцета и волосяной петли. После этого зафиксируйте оба фрагмента эктодермы и контрольные эмбрионы в MEMFA в течение одного часа. Перенесите их в этанол и храните эти ткани при температуре -20 °C.

В данном случае группы ооцитов были инъектированы пулами мРНК, соответствующими постепенно уменьшающемуся количеству клонов или колоний, после чего их культивировали совместно с анимальными шапочками. Впоследствии определяли количество анимальных шапочек в каждой группе, экспрессирующих foxe3 — маркер, который обычно наблюдается в предполагаемой эктодерме хрусталика от стадий ранней нейральной пластинки до формирования пузырька, и используется здесь для оценки способности к индуцированию хрусталика. С помощью этого метода был идентифицирован ген, кодирующий ядерный фактор ldb1, который способен вызвать ответ по индуцированию хрусталика в 50 из 179 (или 28%) исследованных анимальных шапочек.

Здесь представлены изображения гибридизации in situ, на которых сигнал foxe3 (отмечен стрелками) наблюдается в анимальных шапках, культивируемых с ооцитами, в которые была введена ldb1, примерно с 11-й по 23-ю стадию. В соответствующих контрольных анимальных шапках, помещенных на неинъецированные ооциты, экспрессия foxe3 не наблюдается. При подготовке срезов этих анимальных шапок экспрессия foxe3 обнаруживалась как во внутреннем, так и во внешнем слоях эктодермы.

Экспрессия во внутреннем слое характерна для ответа хрусталика. В то же время экспрессия в обоих слоях указывает на другие структуры, такие как обонятельная плакода. После выполнения данной процедуры можно применить такие методы, как иммуногистохимия, гибридизация in situ или прямое детектирование флуоресцентного репортерного гена, чтобы оценить индукционный ответ в эктодерме анимальной части бластосферы.