Исследование комплексообразования ртути (II) с Dicysteinyl тетрапептидов электрораспылительной ионизации масс-спектрометрии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить комплексы ртути и дицистеинилпептидов под различными реакционными стехиометриями, а также охарактеризовать различные комплексы, образованные с помощью ионизации электроспреем и масс-спектрометрии орибитрапа. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся тенденций комплексообразования ртутных и тиоловых соединений, что улучшит рациональный дизайн хелатирующих агентов для секвестрации ионов ртути. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она облегчает анализ комплексов ионов металлов с пренебрежимо малой фрагментацией.

Другие включают в себя четкую схему распределения изотопов ртути. Простота назначения заряда и анализа перекрывающихся пиков с помощью тандемной масс-спектрометрии. Хотя этот метод дает представление о комплексах ртутных пептидов, он также может быть применен к другим комплексам, особенно к ионам металлов, которые существуют в различных изотопных формах.

Дегазируйте пятимиллимолярный буфер формиата аммония в вакуумной системе в течение 10 минут, а затем продуйте аргоном. Повторите дважды и храните раствор под аргоном. В день использования перед использованием отфильтруйте буферный раствор через фильтр 0,2 мкм.

Для приготовления растворов хлорида ртути необходимо взвесить 0,2375 грамма хлорида ртути. Растворите в 25 миллилитрах пятимиллиметрового буфера формиата аммония, чтобы получить 0,035 молярного раствора хлорида ртути. Добавьте 0,214 миллилитров раствора хлорида ртути к 9,785 миллилитров пятимиллиметрового буфера формиата аммония, чтобы получить 0,75 миллимолярного раствора.

Покройте полученный раствор газообразным аргоном. Затем добавьте 225 микролитров пятимиллилярного стокового раствора CGGC к 1,275 миллилитров пятимиллиметрового буфера аммонийного формиата pH 7,5, чтобы получить 0,75 миллимолярного раствора CGGC. Затем приготовьте соотношение ртути к раствору CGGC один к 0,5, поместив 255 микролитров пятимиллиметрового буфера аммонийного формиата pH 7,5 в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем добавьте в пробирку 30 микролитров 0,75 миллимолярного раствора хлорида ртути. Ввергните раствор в течение 10 секунд. Затем добавьте в пробирку 15 микролитров 0,75 миллимолярного раствора CGGC.

Вортексируйте раствор еще на 10 секунд, а затем дайте раствору постоять 10 минут перед введением в масс-спектрометр. Чтобы приготовить масс-спектрометр ESI, или МС, наберите 100 микролитров калибровочных стандартов в стеклянный шприц объемом 500 микролитров. Поместите шприц в подставку шприца помпы MS.

Подсоедините трубку, и введите в масс-спектрометр. Настройте имя файла для прогона, щелкнув значок файла и введя имя файла. Нажмите кнопку «Получить данные» в модуле сбора данных и выполните 150 сканирований.

Проанализируйте хроматограмму для проверки калибровочных стандартов, открыв модуль обработки данных программного обеспечения. Затем перейдите в меню файла и выберите «Открыть», а затем файл в диалоговом окне. Убедитесь, что пики на хроматограмме коррелируют с соотношением массы и заряда стандартов.

Очистите стеклянный шприц объемом 500 микролитров, набрав 500 микролитров метанола класса ВЭЖХ, а затем раздав его в стакан. Наберите 500 микролитров метанола класса ВЭЖХ в стеклянный шприц и промойте систему. Выберите модуль настройки метода программного обеспечения, чтобы задать параметры.

Выберите меню режима сканирования и определите анализаторы FTMS, затем нажмите OK. Затем нажмите на различные значки на странице просмотра спектра в реальном времени, чтобы настроить параметры, как подробно описано в текстовом протоколе. Чтобы запустить буфер, поместите 500 микролитров пятимиллимолярного буфера из формиата аммония в стеклянный шприц объемом 500 микролитров.

Поместите его в подставку шприца насоса MS и отсоедините трубку. Пропустите буфер через трубку на одну-две минуты. Настройте имя файла для прогона, щелкнув значок файла и введя имя файла.

Нажмите кнопку «Получить данные» в модуле и соберите 150 сканов. Нажмите кнопку «Остановить прогон», чтобы остановить сбор данных после того, как будет собрано 150 сканирований. Далее откройте модуль браузера данных, перейдите в меню «Файл» и выберите «Открыть», а затем файл в диалоговом окне.

Убедитесь, что при перезаряде 483, 683, 1163 и 1363 по массе отсутствуют пики, напоминающие пептидные или ртутные ионные пептидные комплексы. Запустите раствор соотношения 0,5 ртутного столба к CGGC, поместив 250 микролитров образца в шприц. Поместите шприц в подставку шприца насоса MS.

Прикрепите трубку и загрунтуйте аппарат. Получив 150 сканов данных, откройте модуль браузера, перейдите в меню «Файл» и выберите пункт «Открыть». Затем выберите файл в диалоговом окне.

Убедитесь, что хроматограмма содержит пики, в том числе только для пептида CGGC. Важнейшим аспектом этой процедуры является обеспечение полного удаления аналитов из предыдущего прогона перед каждым анализом реакционной смеси. Минимизация загрязнения проб из переносимых аналитов обеспечивается за счет тщательной очистки линии впрыска.

Промойте шприц, аспирировав 500 микролитрами буфера формиата аммония, а затем распределите буфер в стакан. Затем нажмите кнопку сброса на MS и трижды промойте трубку 500 микролитрами буфера формиата аммония. Далее промойте шприц, отасунув 500 микролитров метанола и раздав в стакан.

Промойте трубку один раз 500 микролитрами метанола. Затем выберите кнопку детектора нагрузки на MS. Добавив в шприц 500 микролитров буфера формиата аммония, поместите шприц в подставку шприца насоса MS. Прикрепите трубку и загрунтуйте аппарат.

Выберите имя файла для прогона буфера, как и раньше, и выполните 150 сканирований, прежде чем нажать кнопку «Остановить прогон». Откройте модуль браузера данных, чтобы убедиться, что на хроматограмме отсутствуют пики от предыдущего прогона ртути до CGGC. Повторите процедуру анализа для остальных образцов CGGC.

Чтобы приготовить соотношение ртути к раствору CEEC один к 0,5, поместите 255 микролитров пятимиллиметрового буфера аммонийного формиата pH 7,5 в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте в пробирку 30 микролитров 0,75 миллимолярного раствора хлорида ртути. После вортексирования раствора в течение 10 секунд добавьте в пробирку 15 микролитров 0,75 миллимолярного раствора CEEC.

Переведите раствор на вихре еще на 10 секунд. И дайте раствору постоять 10 минут перед введением масс-спектрометра. Повторите процедуру анализа с использованием образцов CEEC и реакционных смесей ионов ртути и CEEC.

Показан репрезентативный масс-спектр. Через 10 минут видны различные типы пептидных комплексов ртути для реакционной смеси от одного до 0,5 ртутного столба и CGGC, а также пик пептида 339,08 и димер пептида 677,15. Как видно в предыдущем спектре, реакционная смесь «один к одному» между ртутью и CGGC содержит некоторые сходные пики.

Например, пик 539.03 указывает на комплекс ртути и пептида один к одному. Увеличенный вид показывает характерную изотопную структуру ртути, соответствующую семи основным природным изотопам ртути. Также наблюдается комплекс от одного до двух ртутей к CGGC, о чем ранее сообщалось для дицистеинилтрипептида ртути.

Этот комплекс присутствует во всех трех реакционных смесях ртути и CGGC. Он был легко проанализирован по четкой изотопной картине ртути с моноизотопным пиком в 877. Однако, если ртути в избытке, как в реакционной смеси один к 0,5 ртути к CGGC, обнаруживается дополнительный комплекс от двух до двух ртутных к CGGC.

Эта изотопная сигнатура ртути соответствует комплексу из двух ртутей, рассчитанному с помощью программы chem cal. Теоретическая масса протонированного моноизотопа соответствует значению перезаряда массы 1077, что является девятым пиком в наблюдаемом изотопном кластере. Показан репрезентативный спектр, показывающий различные комплексы ртути и CEEC.

Интерес представляют перекрывающиеся пики, связанные между ртутью и аддуктами CEEC в заряде плюс один, показывающие моноизотопный пик на уровне 883. А в заряде плюс два, с расчетным значением моноизотопного пика 1765. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за два часа, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о дегазации буферов и тщательной промывке линии, чтобы избежать переноса аналитов. Следуя этой процедуре, можно использовать другие методы, такие как протонная, углерод-13 и ртуть-199 ядерная магнитно-резонансная спектроскопия или потенциометрия, для обеспечения более точного определения комплексов содержимого в фазе раствора. После просмотра этого видео вы сможете анализировать различные комплексы ртути и их различные схемы распределения изотопов ртути и образования зарядов с помощью масс-спектрометрии orbitrap с ионизацией электрораспылением, а также различать перекрывающиеся пики с помощью тандемного MS-анализа.

Не забывайте, что работа с растворами ртути может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты.