Высокое разрешение Количественный Immunogold Анализ мембранными рецепторами на сетчатки синапсах ленточного

Общая цель данного эксперимента заключается в разработке нового подхода к количественному анализу мембранных белков в синапсах ленты сетчатки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии сетчатки, такие как точное расположение белков в синапсах в цепи. Основное преимущество метода заключается в том, что он позволяет оценить количество, плотность и скорость множественных белков в синапсах ленты сетчатки.

Демонстрируя процедуру замораживания и ультратонкого среза, у нас есть доктора Рон Петралия и Я-Сянь Ван из NIDCD Advanced Imaging Core. Для начала этой процедуры препарируйте глазное яблоко под микроскопом. Для этого сначала удалите роговицу.

Затем с помощью щипцов удалите хрусталик и стекловидное тело с межсетчаточной поверхности. После этого отшелушите склеру до тех пор, пока сетчатка не будет изолирована от наглазника. Разрежьте сетчатку сразу на полоски толщиной 100-200 микрометров с помощью бритвы.

Затем смешайте полоски сетчатки с 4%-ным параформальдегидом в 0,1 молярного PB. Затем в 4% параформальдегида плюс 0,01% глутаральдегида при комнатной температуре. После нескольких промываний в PB, с 0,15 миллимолярного хлорида кальция, криопротектировать полоски сетчатки глицерином в 0,1 молярного PB, перед замораживанием-замещением. Прежде чем поместить замороженную ткань в плоские закладные держатели, вырежьте тонкий круг из прозрачного пластикового листа и поместите его на дно каждого держателя, чтобы облегчить извлечение полимеризованного ящика для образцов после завершения.

Теперь установите автоматическую последовательность в AFS. Заполните AFS жидким азотом и поместите плоские закладные держатели в AFS. Заполните их 1,5%-ным содержанием уранилацетата в метаноле и предварительно охладите.

Чтобы заморозить полоски сетчатки в жидком пропане при температуре 184 градуса Цельсия, используйте тонкую кисть, чтобы поместить образцы на небольшие кусочки двойной клейкой ленты, прикрепленные к металлическим огрызкам на концах погружных стержней. После этого удалите лишний буфер с помощью щетки. Погрузите стержни в жидкий пропан примерно на пять секунд.

Затем перенесите их в AFS с помощью небольшой транспортной камеры, заполненной жидким азотом. Поместив замороженный образец и инструменты, щипцы и скальпель, в AFS, охладите инструменты в камере в течение нескольких минут, прежде чем прикоснуться к тканям. Или охладите их, поместив наконечники инструментов на несколько секунд в небольшую транспортировочную камеру, наполненную жидким азотом.

После этого извлеките пробу и скотч из корешка с помощью тонкого скальпеля. Затем поместите по два куска замороженных секций в каждую из семи лунок в плоский закладной алюминиевый держатель с 1,5% уранилацетата в метаноле. Держите их при температуре 90 градусов Цельсия не менее 32 часов в AFS.

Затем увеличьте температуру ступенчато до 45 градусов Цельсия в автоматической последовательности. После этого трижды промыть образцы в предварительно охлажденном метаноле. Затем постепенно инфильтруйте образцы низкотемпературными смолами для встраивания в качестве среды для встраивания.

На следующий день снова смените смолу и отрегулируйте уровень смолы, чтобы достичь верхнего края лунок. Настройте ультрафиолетовое излучение на AFS и полимеризуйте образцы с помощью ультрафиолетового света в AFS до конца автоматической последовательности. Затем извлеките образцы из AFS.

Как правило, образцы блоков все же демонстрируют некоторый розовый оттенок и цвет. Поместите образцы рядом с флуоресцентным светом в вытяжной шкаф для химических веществ при комнатной температуре на ночь или до тех пор, пока они не станут полностью прозрачными. На этом этапе вырежьте ультратонкие секции толщиной 70 нонометров с помощью ультрамикротома и соберите их на никелевых сетках с углеродным покрытием formvar.

Промойте решетки в дистиллированной воде один раз, а затем три промывки TBS. Затем инкубируйте сетки в 20 микролитрах 5% БСА в TBS в течение 30 минут, а затем в 20 микролитрах смеси, содержащей козий анти-CTB и антитело к одной субъединице NMDAR, в течение ночи при комнатной температуре. После этого трижды промойте сетки по 20 микролитров TBS каждый раз при pH 7,6.

Затем один раз промойте сетки с TBS при pH 8,2 в течение пяти минут. Инкубируйте сетки в течение двух часов с 20 микролитрами смеси, содержащей Donkey Antirabbit IGG, соединенный с 10-нанометровыми золотыми частицами, и Donkey-Anti-goat IGG, соединенный с 18-нанометровыми золотыми частицами. Через два часа промойте решетки в 20 микролитрах TBS, при pH 7,6 три раза, затем промойте в ультрачистой воде, а затем высушите решетки на воздухе.

восьми минут в дистиллированной воде добавляйте 5% уранилацетата, а затем 0,3% цитрата свинца в дистиллированную воду в течение пяти минут в темноте. Для экспериментов с тройным мечением инкубируйте сетки в течение ночи при комнатной температуре с 20 микролитрами смеси антикозьего CTB, антимышиного PSD-95 и анти-кроличьего UN2A. Затем инкубируйте сетки в течение двух часов с 20 микролитрами смеси IGG, соединенных с 18, 10 и пятью нанометровыми частицами золота.

В этом разделе сначала установите масштабную линейку. Затем измерьте длину PSD отдельных дендритов RGC с помощью программного обеспечения ImageJ. Затем подсчитайте частицы золота в пределах 10 нанометров от мембраны, исходя из средней толщины плазматической мембраны от семи до девяти нанометров.

Рассчитайте плотность частиц как количество частиц золота на линейный микрометр. Затем измерьте расстояние между центром каждой золотой частицы и серединой PSD для синаптического расположения или краем PSD для внесинаптического расположения. На этом изображении показано двойное мечение иммунозолотом GluA2/3 и CTB.

Это пресинаптическая лента, и мелкие частицы золота группируются в PSD процессов RGC. На этом изображении показано двойное мечение иммунозолотом GluN2B и CTB. Мелкие частицы золота находятся на внесинаптической плазматической мембране.

На этом изображении показано двойное иммунозолотое мечение GluN2A и CTB. Подобно GluA2/3, мелкие частицы группируются внутри PSD. Здесь показано тройное мечение иммунозолотом GluN2A, PSD-95 и CTB.

Частицы золота GluN2A и частицы золота PSD-95 колокализуются в PSD на отдельных CTB-положительных дендритах RGC. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о необходимости очень осторожной фиксации ткани, потому что некоторая антигенность белков, например, антигенность NMDA-рецепторов, заметно снижается при сильной длительной фиксации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как с большой точностью обнаруживать и анализировать мембранные белки на синапсах ленты сетчатки.