Оценка Planar-Cell-полярности фенотипов в цилиопатии Mouse Mutant улитки

Общая цель этого протокола заключается в исследовании цилиарно-мутантной улитки мыши на фенотипы полярности планарных клеток. Эти методы позволяют детально изучить фенотип улитки, что приведет к более точному пониманию ресничного участия в установлении передачи сигналов PCP у позвоночных. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что после освоения расчлененный эпителий улитки может быть использован для различных видов фенотипического анализа.

После получения реагентов и тканей от экспериментальных животных, на стадии развития от E16.5 до p3, с помощью лезвия скальпеля или небольшой пары ножниц рассекают голову вдоль сагиттальной средней линии, начиная с носа и продолжая семядолей. Удалите мозг из каждой половины черепа с помощью пары щипцов. Затем определите височные кости, которые содержат развивающиеся костные лабиринты внутреннего уха.

Работая с образцом под диссекционным микроскопом, используйте пару щипцов, чтобы оторвать костные лабиринты от черепа, осторожно проводя щипцами под костными лабиринтами. После рассечения используйте кончик рассекающих щипцов, чтобы очистить овальные и круглые окна и сделать небольшое отверстие в верхушке спирали улитки. Затем зафиксируйте костные лабиринты в 1,5 миллилитрах 4% параформальдегида на пять минут на льду, чтобы обеспечить легкое удаление текториальной мембраны.

Теперь поместите костные лабиринты в черную силиконовую чашку для препарирования, покрытую силиконовым эластомером, содержащую PBS для облегчения вскрытия. С помощью щипцов номер пять удалите наружный хрящ, обнажив кохлеарный проток. Начните с овального окна, вставьте нижний кончик щипцов в овальное окно и аккуратно подденьте хрящ, медленно продвигаясь вверх к вершине.

Затем с помощью тонкой пары щипцов зажмите мембрану Рейсснера у основания улиткового протока и снимите ее восходящим движением. Визуализируйте дорсальную сторону улиткового протока, включая сенсорный эпителий. Затем с помощью щипцов No 55 защемите текториальную мембрану у основания улитки и отслайте вверх к вершине.

Полное удаление текториальной мембраны требуется для получения наилучших изображений с иммуногистохимическим анализом и имеет важное значение для сканирующей электронной микроскопии. После обнажения кортиевого органа дополнительно фиксируют ткань и выполняют иммуногистохимию, либо готовят к сканирующей электронной микроскопии, как подробно описано в письменной части протокола. После того, как ткань будет окрашена, поместите образец в черную чашку из силиконового эластомера, содержащую PBS.

С помощью тонких щипцов удалите вестибулярную область из улитковой спирали. Затем очень аккуратно удалите нижележащий хрящ и мезенхиму из улитковой спирали. Оставшаяся спираль улитки содержит внутреннюю борозду, кортиевый орган и внешнюю борозду.

Перенесите спираль улитки в каплю PBS, помещенную на предметное стекло микроскопа. Удалите PBS с помощью абсорбирующей салфетки или листа фильтровальной бумаги и аккуратно переместите спираль улитки, если эпителий сместился и перекрывается на себя. Добавьте каплю монтажного носителя непосредственно на образец улитки и аккуратно приложите защитное стекло непосредственно к образцу, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха.

Используйте эпифлуоресцентный или лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, оснащенный объективами с большим увеличением и высокой числовой апертурой, для получения изображений апикальной поверхности волосковой клетки улитки. Используйте более низкие объективы, чтобы получить перекрывающиеся изображения улитковой спирали для количественной оценки длины улиткового протока. На следующих изображениях показано иммунофлюоресцентное окрашивание базального поворота, послеродовой тип улитки первого дня.

Фаллоидин помечает филаментный актин в стереоцилиях, а кортикальный актин — на периферии клетки. Миозин VIIA является маркером для внутренних и наружных волосковых клеток. ZO_1 обозначает плотные соединения между клетками, что делает его отличным маркером для различения границ клеток.

Ацетилированный альфа-тубулин используется в качестве маркера для киноцилия в вершине пучка, как указано белой стрелкой. Внутренние микротрубочки также помечены ацетилированным альфа-тубулином, который особенно распространен в клетках столбов, на что указывают белые звездочки. На этом изображении рассеченных улитковых протоков в точке E18.5, окрашенных ацетилированным тубулином, показано заметное укорочение условных нокаутных кохлеарных протоков IFT20 по сравнению с контролем.

На следующем изображении показан полный препарат базального кохлеарного поворота у мышей с нокаутом BBS8 на нулевой день после рождения. Стереоцилиарные пучки у нокаутных улиток BBS8 поворачиваются по-разному, как показано стрелкой вправо, или сплющены и неправильно локализованы, как указано средней стрелкой. Киноцилии неправильно локализованы, или аксонемы отсутствуют, на что указывает стрелка влево.

При подготовке фенотипа улитки к анализу важно помнить, что различия в генетическом фоне могут изменить фенотип улитки. Поэтому для анализа важно использовать контроль однопометника. Дальнейший анализ включает аудиометрическое тестирование и культивирование кохлеарных эксплантов, что позволяет проводить обработку различными сигнальными активаторами или ингибиторами, тем самым способствуя механистическому пониманию вовлеченных процессов развития.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить ткань улитки к анализу роли цилиарных компонентов и их различных эффектов на передачу сигналов PCP.