Всего горе Вскрытие и Иммунофлуоресценции взрослых мышей улитки

Мы представляем метод, чтобы изолировать взрослых орган Корти, как три неповрежденных кохлеарных поворотов (вершины, середины и основания). Мы также продемонстрировать процедуру иммуноокрашивания с флуоресцентно меченых антител. Вместе эти методы позволяют изучать волосковых клеток, поддерживающих клеток, и другие типы клеток, найденный в улитку.

Общая цель всего этого метода вскрытия маунта состоит в том, чтобы изолировать сенсорную область кальцинированной улитки взрослого человека в виде трех неповрежденных витков: вершины, середины и основания. Этот метод диссекции сохраняет трехмерную структуру кортиевого органа и позволяет визуализировать все клетки в сочетании с иммуноокрашиванием и конфокальной микроскопией для получения изображений в разных плоскостях по оси Z. По сравнению с предыдущими методами диссекции, мы используем другую стратегию, которая генерирует три кохлеарных поворота, которые больше и с меньшей вероятностью будут потеряны или повреждены в процессе иммуноокрашивания.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как вскрытие трудно освоить. Поскольку кортиевый орган является хрупким, существует небольшое право на ошибку при удалении спиральной связки. После усыпления животного в соответствии с утвержденными процедурами и удаления мозга начните с идентификации височных костей в основании черепа мыши.

Затем соскребите черепно-мозговые нервы с помощью щипцов стандартного образца. Поместите щипцы на кончик глазной капсулы и большим пальцем противоположной руки надавите на задний полукружный канал, чтобы сместить инкапсулированную улитку. Освободите нижнюю половину височной кости от черепа либо вручную большим и указательным пальцами, либо с помощью 10,5-сантиметровых ножниц, и поместите в метанол свободной электронной микроскопии 4% параформальдегида для фиксации.

После фиксации следует провести декальцификацию височных костей в соответствии с инструкциями в письменной части протокола. Чтобы определить, достаточно ли декальцинирован образец, поместите височные кости на чашку для препарирования с силиконовым покрытием и аккуратно надавите щипцами на улитку в форме улитки. Если ткань губчатая, то декальциноза полная.

Добавьте PBS в диссекционную чашку, а затем, работая под стереодиссекционным микроскопом, используйте щипцы номер четыре или номер пять, чтобы удерживать височную кость в вестибулярной области, и пружинные ножницы Ваннаса-Тюбингена объемом пять миллилитров, чтобы отрезать лишнюю ткань капсулы глаза по бокам и над верхушкой. С помощью пружинных ножниц Vannas объемом 2,5 миллилитра вставьте одно лезвие в овальное окно и сделайте несколько небольших надрезов по спиральной связке базального витка. Теперь вставьте одно лезвие пятимиллилитровых пружинных ножниц Vannas-Tubingen в только что разрезанную область, а другое лезвие поместите на внешнюю сторону височной кости, медиально к овальному окну.

Этот срез отделяет прикорневой виток от среднего и апикального витков. Далее, чтобы завершить рассечение базального витка, с помощью пружинных ножниц объемом 2,5 миллилитров разрежьте спиральные ганглиозные нервные волокна, которые соединяются с модиолусом, чтобы снять напряжение в базальном повороте. Срез ниже базального поворота отделить от вестибулярных органов.

Используйте щипцы для направления тканей и прикрепите спиральные ганглиозные волокна к чашке, покрытой силиконом и эластомером. Сделайте ряд небольших надрезов, чтобы удалить спиральную связку как сверху, так и снизу кортиевого органа. С помощью спиральных ганглиозных волокон, прикрепленных к чашке, покрытой силиконом и эластомером, с помощью щипцов удалите остатки мембраны Рейсснера из кортиевого органа.

Сделайте несколько надрезов, чтобы уменьшить толщину спиральных ганглиозных аксонов. Затем обхватите щипцами оставшиеся аксоны спирального ганглия и перенесите рассеченный базальный виток на 48-луночную пластину, содержащую примерно 500 микролитров PBS. Теперь разделите средний и апикальный повороты, поместив сначала оставшиеся две трети улитки апикальной стороной вниз.

Затем вставьте одно лезвие ножниц объемом 2,5 миллилитра в среду скалы, где средний виток ранее соединялся с базальным витком, и сделайте несколько надрезов по спиральной связке среднего витка. С помощью пятимиллилитровых ножниц вставьте одно лезвие в область разреза, а средний оборот поместите поверх лезвия. Поместите другое лезвие на внешнюю сторону костного лабиринта, под углом 90 градусов от апикального кончика.

Этот срез отделяет средний виток от верхушечного. Далее завершите рассечение среднего витка, удалив спиральную связку из органа корти. Переложите рассеченный виток на 48 луночную пластину, как и раньше.

Теперь с помощью пружинных ножниц Vannas объемом 2,5 миллилитра откройте колпачок, который закрывает апикальный поворот, и повторите процедуру по удалению спиральной связки апикального витка из органа корти. Переложите рассеченный виток на 48 луночную пластину, как и раньше. Чтобы начать процедуру иммуноокрашивания, сначала аспирируйте PBS из каждой лунки, затем замените на 200-300 микролитров блокирующего раствора и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре на 3D-ротаторе.

По истечении времени инкубации удалите блокирующий раствор и замените его 100 микролитрами первичного антитела, разведенного соответствующим образом в растворе-носителе. Инкубируйте в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на 3D-ротаторе. На следующий день удалите первичный раствор антител и промойте каждую лунку 500 микролитрами PBS в течение не менее пяти минут каждый раз при комнатной температуре.

Повторите стирку дважды. После последнего промывки аспирируйте PBS и будьте осторожны, чтобы не засосать рассеченный виток в наконечнике пипетки. Замените на 100 микролитров на лунку флуоресцентно меченного вторичного антитела, разведенного в растворе носителя.

Поместите планшет на 48 лунок в черный ящик для защиты от света и поместите на 3D-вращатель для инкубации в течение двух-трех часов при комнатной температуре. После инкубации аспирируйте вторичный раствор антител и трижды промойте PBS, как и раньше. После удаления последней промывки добавьте 100 микролитров Hoechst в ядра этикетки.

Защитите от света и инкубируйте в течение 15-20 минут при комнатной температуре на 3D-ротаторе. Наконец, удалите раствор Hoechst и трижды промойте PBS, как и раньше. После нанесения этикетки на каждое предметное стекло нанесите пипеткой 50 микролитров монтажного носителя на каждое предметное стекло.

Затем с помощью прямых ювелирных щипцов номер четыре или номер пять возьмитесь за аксоны спирального ганглия и аккуратно перенесите один кохлеарный оборот с 48-луночной пластины на монтажный носитель. Используйте микроскоп, чтобы убедиться, что рассеченный виток не сложен и не скручен. Поместите один конец защитного стекла на предметное стекло и осторожно отпустите, чтобы защитное стекло упало.

Используйте стереодиссекционный микроскоп, чтобы убедиться, что поворот улитки не расположен рядом с пузырьком воздуха. В этом случае осторожно переместите защитный колышек вперед и назад, чтобы изменить положение поворота улитки. Повторите процедуру для других поворотов улитки.

Установите один поворот улитки на предметное стекло, чтобы предотвратить воздействие света и обесцвечивание фотографий в процессе съемки. Поместите слайды в папку для слайдов так, чтобы они лежали ровно. Защищайте от света и дайте монтажному материалу застыть в течение ночи при комнатной температуре.

На следующий день закройте крышку прозрачным лаком для ногтей и храните при комнатной температуре или 20 градусах Цельсия до получения изображения. На этом изображении конфокального среза показан средний поворот улитки, изолированный от мыши p15. Изображения 420X были наложены для реконструкции всего среднего поворота.

Волосковые клетки, помеченные кроличьим первичным антителом против миозина VIIa и конъюгированным вторичным антителом Alexa 647, выглядят пурпурными. Поддерживающие клетки, меченные козьим первичным антителом против SOX2 и конъюгированным вторичным антителом Alexa 568, отображаются зеленым цветом. Ядра выглядят синими из-за пятна Хёхста.

Масштабная линейка представляет собой 100 микрон. На этом изображении показано оптическое поперечное сечение среднего витка, изолированного от шестинедельной мыши в плоскости X, Z. Опять же, волосковые клетки помечены пурпурным флуорофором, а поддерживающие клетки — флуорофором, который выглядит зеленым.

Это увеличенное увеличение по сравнению с предыдущим изображением, при этом перекрестие удалено. Масштабная линейка представляет собой 20 микрон. На следующих четырех изображениях показаны некоторые проблемы, которые могут возникнуть при рассечении всего крепления или при монтаже улитки на слайдах.

Здесь, в левой части изображения, кохлеарная ткань была разрезана рядом с последним рядом наружных волосковых клеток, в результате чего многие из этих клеток были установлены под разными углами. На этом изображении отрезана часть кортиевого органа с левой стороны. В центре изображения в области наружных волосковых клеток пробито отверстие.

Здесь орган Корти сложен в нескольких местах. После освоения вся техника рассечения монтировки может быть завершена за 20-30 минут. При выполнении этой процедуры важно избегать размещения щипцов на кортиевом органе и избегать натяжения или захвата спиральной связки.

Вместо этого закройте щипцы и приколите спиральные волокна ганглия к чашке, покрытой силиконом и эластомером. Образцы от мышей в возрасте от одной до трех недель более щадящие и полезны для изучения метода вскрытия. Кроме того, образцы с поврежденными волосковыми клетками труднее препарировать, а ткани, подверженные воздействию шума, особенно сложными и хрупкими.

После этой процедуры диссекции могут быть выполнены другие методы, такие как сканирующая электронная микроскопия. Однако требуется другой фиксатор. Кроме того, мы внесли небольшие изменения в этот протокол для вскрытия ткани улитки крысы, и в будущем мы надеемся внести дополнительные изменения для вскрытия улитки у шиншиллы, песчанки и морской свинки.