Au-Взаимодействие SLP1 Полимеры и монослоя от Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ИСП-МС и АСМ, как инструменты для биомолекулы металлов исследований

Общей целью данного эксперимента является исследование сорбционного поведения золота белками S-слоя представленного бактериального штамма с экологической и технологической точек зрения. Эти методы могут ответить на ключевые вопросы в науке, связанной с окружающей средой, в таких областях, как сорбционные процессы и удаление и восстановление металлов. Основное преимущество этих методов заключается в том, что вы можете обнаружить сорбцию металлов и адсорбцию наночастиц в другом диапазоне масштабов.

С помощью QCM-D можно обнаружить это в режиме реального времени. Чтобы начать эту процедуру, оснастите жидкостные ячейки манекенами датчиков. Закачайте не менее 20 миллилитров на модуль 2%-ного щелочного жидкого чистящего средства в сверхчистую воду через систему QCM-D и трубку.

После этого прокачать через систему пятикратный объем на модуль сверхчистой воды с расходом до 300 микролитров в минуту по протоколу производителя. Очистите датчики диоксида кремния за пределами проточных модулей путем инкубации в 2%-ном растворе додецилсульфата натрия в течение не менее 20 минут. Затем несколько раз промойте датчики сверхчистой водой.

После сушки кристаллов отфильтрованным сжатым воздухом поместите их в камеру очистки озона на 20 минут. После этого дважды повторите процедуру очистки, чтобы удалить все органическое содержимое. Чтобы удалить связанные металлы с поверхности датчика, промойте датчики одной молярной азотной кислотой.

Затем несколько раз промойте датчики сверхчистой водой. Затем модифицируйте датчики с помощью трех граммов на литр чередующихся слоев полиэтиленимина и сульфоната полистирола путем нанесения покрытия погружением методом послойно или методом LBL. Поместите датчики в соответствующий раствор полиэлектролита в глубоколуночные планшеты и инкубируйте их в течение 10 минут при комнатной температуре.

Затем извлеките датчики из раствора полиэлектролита и интенсивно промывайте их между каждым этапом нанесения покрытия сверхчистой водой. После завершения внешней модификации поместите датчики внутрь модуля расхода. Уравновесьте датчики, промыв их сверхчистой водой перед началом экспериментов.

На этом этапе растворяют ранее выделенный и очищенный Slp1 в формуле мочевины для превращения полимеров в мономеры. Центрифугируйте мономеризированные белки при температуре 15 000 г и 4 градусах Цельсия в течение одного часа, чтобы удалить более крупные белковые агломераты. Смешайте растворимую и центрифугированную надосадочную жидкость Slp1 с буфером для рекристаллизации до конечной концентрации белка 0,2 грамма на литр.

После успешной рекристаллизации белка на вершине модифицированных полиэлектролитом сенсоров внутри модулей потока необходимо интенсивно промыть покрытые сенсоры буфером для рекристаллизации со скоростью потока 125 мкл в минуту до тех пор, пока не будут обнаружены стабильные значения сдвигов частоты и диэлектрических потерь. После успешного нанесения покрытия Slp1 в проточные модули полученный слой Slp1 интенсивно промывают 1,6 миллимолярным цитратным буфером pH 5,0 до тех пор, пока не будут обнаружены стабильные значения сдвигов частоты и диэлектрических потерь. Далее закачивают в модули потока заранее приготовленный раствор наночастиц в один миллимоляр с расходом 125 микролитров в минуту.

Затем отслеживайте адсорбцию массы к слою Slp1. После завершения взаимодействия с наночастицами металла промойте слой буфером, не содержащим наночастиц, чтобы удалить слабо связанные металлы или наночастицы. Используя атомно-силовой микроскоп или АСМ с инвертированным оптическим микроскопом, записывайте изображения в жидкости с использованием сверхчистой воды непосредственно на датчики QCM-D с покрытием.

Промойте датчики сверхчистой водой после экспериментов QCM-D и поместите их внутрь жидкостной ячейки АСМ. Используйте кантилевер с резонансной частотой примерно 25 килогерц в воде и жесткостью менее 0,1 ньютона на метр. Отрегулируйте скорость сканирования в диапазоне от 2,5 до 10 микрометров в секунду.

Делайте снимки в динамическом контактном режиме, в то время как консоль возбуждается пьезонапряжением на его резонансной частоте. Наконец, определите расстояние консоли до поверхности по гашению колебаний. Максимальные возможности связывания золота 3 с суспензией Slp1 показывают, что оно было стабильно связано в течение 24-часовой инкубации в исследуемом диапазоне pH.

Немедленное снижение частоты свидетельствует о быстрой адсорбции и высоком сродстве белков к модифицированной полиэлектролитом поверхности. Диссипация также немедленно увеличивается, что указывает на адсорбцию вязкоупругих молекул к поверхности из-за быстрого демпфирования, что приводит к увеличению значений диэлектрических сил. Предварительно синтезированные нулевые наночастицы золота были инкубированы с Slp1 и проанализированы с помощью SDS-PAGE, которая подтвердила данные QCM-D, показавшие, что наночастицы не нарушают структуру Slp1.

Адсорбция предварительно синтезированных металлических нулевых наночастиц золота показана в экспериментах QCM-D на дельта-F-дельта D-графиках и в виде профилей толщины и массы. Здесь показана белковая решетка Slp1, перекристаллизованная на модифицированных полиэлектролитами сенсорах. Постоянная решетки была определена как от 13 до 14 нанометров, а толщина слоя оказалась равной 10 плюс-минус два нанометра.

Исследования АСМ подтвердили, что после взаимодействия трех золотых волокон решетка Slp1 осталась полностью неповрежденной, что подтверждает результаты QCM-D, предсказывающие стабильность покрытия. АСМ проверяет адсорбцию нулевых наночастиц золота на решетке Slp1, но из-за размера частиц они не следуют p4-симметрии Slp1. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение одного рабочего дня, если она выполнена правильно.

Следуя этим методам, можно использовать другие методы, такие как инфракрасная спектроскопия или микроскопия ионов гелия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как специфические связывающие прицелы или взаимодействие с золотом или наночастицами золота. Представленный метод проложил путь для изучения взаимодействия биомолекул с металлами и, например, поведения адсорбции и десорбции на различных поверхностях. После просмотра этого видео вы теперь должны хорошо понимать, как исследовать взаимодействие металлов с биологическими растворителями, и пожалуйста, когда вы используете этот метод, не забывайте использовать очки, лабораторный халат и, конечно же, также перчатки.