Трехмерная Биомиметический Технология: Роман Biorubber Создает Определено микро- и макроуровне архитектур в коллагене гидрогелей
12 февраля 2016 г.
Инновационная технология биопроизводства была разработана для создания трехмерных конструкций, которые напоминают архитектурные особенности, компоненты и механические свойства тканей in vivo. В этой технике используется недавно разработанный жертвенный материал, каучук BSA, который передает детальные пространственные особенности, воспроизводя in vivo архитектуры самых разных тканей.
Общая цель этого протокола заключается в создании трехмерных коллагеновых каркасов, которые могут напоминать архитектурные особенности, состав и механические свойства тканей in vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии, такие как взаимодействие клеток ECM, влияние архитектурных особенностей на создание инженерных тканей и разработка заменителей тканей, среди прочего. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает жизнеспособную процедуру повторения микрогеометрии внутренних проточных каналов и путей с высокой точностью в биоразлагаемом материале.
Демонстрировать процедуру будет Вероника Родригес-Ривера, научный сотрудник моей лаборатории. Материалы, используемые для приготовления резины BSA, необходимо хранить в холоде до тех пор, пока они не будут готовы к использованию, чтобы резина BSA не застыла преждевременно. Стерильность также очень важна для этой процедуры.
Сначала простерилизуйте дозатор. В колпаке для неклеточных культур разложите уплотнительные кольца, шприц, его колпачок, наконечник для смешивания и дозатор четыре к одному. УФ-стерилизуют эти материалы в течение 30 минут.
Сначала закрутите две детали формы из нержавеющей стали вместе и прикрепите замок Люэра. Перед сборкой дозатора распылите пипетки и реагенты с 70% этанолом перед введением их в колпак. Сначала прикрепите колпачок наконечника к держателю раствора.
Затем загрузите 30% раствор BSA в большую камеру, не загрязняя другую камеру. Оставьте достаточно места для крепления уплотнительного кольца. Затем загрузите меньшую камеру дозатора трехпроцентным глутаральдегидом и прикрепите еще одно уплотнительное кольцо.
Теперь приложите шприц к дозатору. Затем наклоните сборку так, чтобы крышка оказалась сверху, и установите крышку на наконечник для смешивания. Затем осторожно постучите по бокам, чтобы пузырьки воздуха поднялись вверх.
Затем поместите дозатор внутрь автоклавного пакета, чтобы вместить отработанный раствор. В пакете, установив диспенсер в вертикальном положении, налейте небольшое количество раствора, чтобы очистить весь воздух из шприца. Удаление воздуха очень важно.
Затем быстро прикрепите замок Люэра Y-образной формы из нержавеющей стали к кончику шприца. Теперь, держа форму в недоминирующей руке, чередуйте выбрасывание раствора в левый и правый выпускные отверстия выходных каналов. Надавите на выхлопные трубы, заполнив таким образом раствором внутренние пустоты.
Затем расположите форму горизонтально и введите в нее больше раствора, пока не будет использована половина объема дозатора. Теперь форму следует поместить в посуду, завернуть в парапленку и хранить при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. Эта процедура масштабируется до четырех граммов подкисленного коллагена.
Храните его охлажденным до тех пор, пока он не будет использован. После того, как коллаген будет взвешен, приступайте к стерилизации раствора с помощью гамма-излучения. При приготовлении внесите свежий 0,2 нормального раствора HEPES в воду.
Затем переложите содержимое в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Отрегулируйте pH до девяти с помощью концентрированного гидроксида натрия. Обязательно простерилизуйте капюшон ультрафиолетовым излучением и автоклавируйте щипцы, шпатель и скальпель.
В вытяжке смешайте 1,5 миллилитра раствора HEPES с 1,5 миллилитрами 10x MEM. Храните эту смесь на льду. Также охладите 12-луночную тарелку и 20-миллилитровый шприц в морозильной камере в течение 10 минут.
Для дополнительной стерильности распылите на пробирки и пластины 70% этанола перед тем, как поместить их в колпак. Распылите распыление на пластину формы и поместите ее в колпак. Затем снимите резиновые формы BSA с помощью щипцов.
Затем вырежьте из формы вытяжные каналы с помощью скальпеля. Далее кратковременно перемешайте смесь HEPES-MEM и добавьте один миллилитр к коллагену. Затем тщательно перемешайте раствор стерильным шпателем.
Далее следует кратковременный вихрь, и быстро переложите раствор в холодный, 20 миллилитровый шприц. Теперь, закрепив резину BSA внутри лунки, налейте половину раствора гидрогеля коллагена на дно лунки. Далее с помощью пинцета расположите форму так, чтобы входной и выходной концы резины касались стенок колодца.
Затем накройте форму гидрогелем с коллагеном. Теперь запечатайте лунку парапленкой и загрузите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Подождите один час, чтобы коллаген полимеризовался.
В течение этого времени держите включенным ультрафиолетовый свет в капоте. Кроме того, настройте УФ-сшивающий аппарат на выдачу 630 000 микроджоулей на квадратный сантиметр. Теперь распылите на руки в перчатках 70% этанола, загрузите пластину с формами, покрытыми коллагеном, в сшиватель и начните процесс облучения.
После облучения снова распылите на перчатки и выгрузите пластину из сшивателя. Затем с помощью стерильного шпателя извлеките гель из лунки, переверните его, и сшейте дно гидрогеля крест-накрест. После заключительного цикла сшивания приступайте к расщеплению фермента.
Чтобы удалить резину БСА, не нарушая коллагеновый каркас, используйте стерильный 0,25% раствор трипсина при pH 7,8 и продавите его через фильтр 0,20 микрона. Достаточно переложить отфильтрованный раствор трипсина в новую 50 миллилитровую коническую трубку. Затем перенесите гидрогель с коллагеном в коническую трубку, в которой находится раствор фермента.
Убедитесь, что гидрогель полностью покрыт раствором. Заклейте трубку парапленкой и аккуратно закрутите ее примерно на минуту. Затем инкубируйте пробирку при температуре 30 градусов Цельсия и дайте пищеварению идти в течение 15-24 часов.
В течение первых четырех часов извлекайте трубку каждые 15-30 минут и осторожно втягивайте ее в вихрь, чтобы помочь завершить разложение резины BSA. На следующий день разложение считается завершенным, когда в растворе не плавает резина или в гидрогеле нет разбитых кусочков резины. Теперь замените раствор трипсина стерильным раствором Москонаса и дайте трубке потрясти при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут.
Позже аспирируйте раствор Mosconas и повторите этот шаг еще два раза, чтобы полностью очистить коллагеновый каркас. Для оптимизации использования биокаучука было проведено обширное количество тестов, которые были подробно описаны в текстовом протоколе. С использованием оптимизированного протокола и трех твердых частей пресс-формы были изготовлены и детально изучены коллагеновые гидрогели.
Необходимая форма Y была изготовлена на машине Microlution. В Y-форму впрыскивалось 30% BSA и 3% глутаральдегида, которые реагировали в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Затем резина BSA отливалась с коллагеном и нагревалась до 37 градусов Цельсия в течение часа.
Каучук переваривался ферментом в течение 15 часов, что ослабляло его до точки отваливания, не влияя на геометрию коллагенового гидрогеля. Четырехмиллиметровый входной канал, отлитый пресс-формой, был измерен с помощью штангенциркуля и составил ровно четыре миллиметра в коллагеновом гидрогеле. При испытании устойчивости пресс-формы было обнаружено, что размеры до 300 микрон могут быть надежно спроектированы.
Кроме того, каркасы были проверены на остаточный глутаральдегид после промывки Mosconas, и никаких остатков обнаружено не было. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изготавливать 3D-коллагеновые каркасы с потенциалом имитации геометрии in vivo. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, дополняющие эту технику, такие как создание 3D-моделей тканей in-vivo и изготовление пресс-форм с определенными архитектурными особенностями, чтобы ответить на дополнительные вопросы.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области тканевой инженерии к изучению взаимодействия между внутренними архитектурными особенностями и компонентами матрицы с клетками в моделях in vitro.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена инновационная методика биофабрикации для создания трехмерных коллагеновых каркасов, имитирующих архитектурные особенности и механические свойства тканей in vivo. В методе используется недавно разработанный жертвенный материал — резина из BSA, позволяющий точно воспроизводить микрогеометрию различных тканей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Тканевая инженерия
- Биофабрикация
- Разработка скаффолдов
Теоретическая часть
- Исследование направлено на решение проблемы необходимости в реалистичных моделях тканей для научных изысканий.
- В работе изучаются взаимодействия между клетками и внеклеточным матриксом (ВКМ), а также их значимость для искусственно созданных тканей.
- Данный метод нацелен на повышение точности и функционального соответствия тканевых заменителей.
- Соблюдение стерильности и надлежащее хранение материалов являются критически важными условиями для достижения успеха.
Цель исследования
- Создать скаффолды, максимально приближенные к тканям in vivo.
- Изучить влияние архитектурных особенностей на тканевую инженерию.
- Разработать надежный метод создания биоразлагаемых скаффолдов.
Используемые методы
- Приготовление резинового полимера на основе BSA в контролируемых условиях.
- Использование жертвенного материала для детального переноса пространственных структур.
- Демонстрация процедуры опытным сотрудником с ученой степенью (post-doctoral associate).
- Обеспечение стерильности и правильного хранения материалов.
Основные результаты
- Данный метод позволяет успешно воспроизводить микрогеометрию тканей.
- Достигнута высокая точность при создании внутренних проточных каналов.
- Результаты указывают на возможности применения метода в тканевой инженерии и создании заменителей тканей.
- Продемонстрирована важность правил обращения с материалами в ходе процесса.
Выводы
- Данный метод представляет собой перспективный подход к решению задач тканевой инженерии.
- Он позволяет углубить понимание взаимодействий с внеклеточным матриксом в искусственно созданных тканях.
- Полученные результаты могут привести к достижениям в технологиях замены тканей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод биофабрикации позволяет точно воспроизводить микроархитектуру тканей в коллагеновых гидрогелях, восполняя критический пробел в достоверности доклинических моделей. Обеспечивая масштабируемый способ создания определенных каналов микро- и макромасштаба, этот подход способствует снижению рисков при механистическом обосновании разработки препаратов, нацеленных на определенные ткани. Данный метод повышает прогностическую уверенность при оценке взаимодействий между препаратом и тканью в физиологически релевантных 3D-средах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать, как структурные особенности влияют на взаимодействия между внеклеточным матриксом (ECM) и клетками, а также на активацию сигнальных путей в системах, релевантных для конкретных заболеваний.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимую геометрию скаффолдов для проведения согласованных анализов валидации мишеней в различных сериях экспериментов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Создание стандартизированных коллагеновых каркасов с количественно определяемыми размерами каналов для надежного скрининга соединений в биомиметических средах.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации анализа с помощью метода жертвенных форм, что снижает вариабельность в микрофлюидных моделях тканей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает изучение явлений перфузии и транспорта в скаффолдах, имитирующих архитектуру тканей in vivo, что повышает трансляционную значимость биомаркеров.
- Практическая ценность: обеспечивает преемственность доклинических исследований путем создания скаффолдов с заданной геометрией, подходящих для лонгитюдных исследований созревания тканей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска новых лекарственных средств, предоставляя настраиваемые биодеградируемые скаффолды, которые служат связующим звеном между простыми 2D-моделями и сложными органоидами, обеспечивая проверку гипотез при валидации мишеней.
- Биология открытий: способствует снижению механистических рисков, позволяя контролируемо тестировать, как архитектура скаффолда модулирует клеточный ответ на терапевтические кандидаты.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые гидрогели с заданной архитектурой для количественной оценки проникновения соединений и взаимодействия с мишенью.
- Аналитика: позволяет точно измерять размеры каналов (например, 3 mm и 4 mm) и структурную целостность вплоть до 300 microns, обеспечивая объективные морфометрические показатели.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преемственность с доклиническими исследованиями за счет создания скаффолдов, архитектурные особенности которых могут быть соотнесены с функциональными результатами в тканях.
- Корпоративное повторное использование: создает платформу для генерации стандартизированных имитаторов тканей в нескольких проектах с помощью форм, разработанных в CAD, и формовки из резины BSA.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в моделях тканевой инженерии за счет изоляции архитектурных переменных в исследованиях передачи сигналов между ВКМ и клетками.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированного изготовления и ферментативного удаления резины из BSA, сводя к минимуму вариабельность между партиями.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), предоставляя данные по скаффолдам, которые лучше воспроизводят ограничения распределения лекарств и поведения клеток в тканях in vivo.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию терапевтических средств с учетом рисков на основе их эффективности в архитектурно определенных системах, имеющих значение для конкретных заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с биоматериалами, владение методами стерильной обработки и оптимизации ферментативного переваривания.
- Необходим доступ к программному обеспечению CAD, оборудованию для прецизионного формования (например, Microlution) и системам контролируемой инкубации/сшивания.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется межкомандная стандартизация дизайна форм, подготовки резины из BSA и протоколов создания коллагенового гидрогеля.
- При переносе метода на другие концентрации коллагена или альтернативные природные полимеры необходимо учитывать особенности адаптации.
- Практические ограничения включают необходимость холодного хранения прекурсоров резины из BSA и длительное время переваривания (15–24 часа) для полного удаления жертвенного материала.
