Воображение CD4 Т-клеток Внутритканевая миграции в воспаленном дермы

Общая цель этого протокола визуализации заключается в визуализации динамики CD4-положительных Т-клеток в воспаленной коже. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, например, каковы механизмы, лежащие в основе подвижности иммунных клеток и их функции в воспаленных тканях. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает минимально инвазивный способ изучения динамического поведения CD4 Т-клеток in situ.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как шаги по подготовке уха к визуализации сложны для освоения, а правильное положение уха необходимо для получения высококачественных изображений. Меня зовут Элисон Гейло, я аспирантка, и я буду демонстрировать этот протокол. Начните с аспирации 300 микролитров флуоресцентно меченой суспензии эффекторных Т-клеток на каждую мышь в шприц, оснащенный иглой 27 с половиной калибра.

Затем поверните иглу шприца вверх и осторожно поверните стержень шприца, перемещая поршень вверх и вниз по мере необходимости, чтобы удалить любые пузырьки. Когда клетки будут готовы, пересадите мышей в чистую клетку, и поместите их под тепловую лампу, пока хвостовые вены не расширится. Затем переложите первую мышь в удерживатель, а хвост протрите спиртовым тампоном.

После выявления боковой хвостовой вены медленно введите в вену 200 микролитров клеток. Когда все клетки будут перенесены, наберите 50 микролитров полной эмульсии флуоресцента в инсулиновый шприц 28 с половиной калибра и сильно надавите на поршень, чтобы удалить любые крупные пузырьки воздуха. Затем наденьте наперсток на указательный палец левой руки и осторожно возьмитесь за ухо мыши между большим пальцем левой руки и наперстком так, чтобы вентральное ухо было обращено вверх.

Затем проведите иглой скошенной стороной вверх в дерму в наружной трети ушной раковины, немного смещенную от центра, и медленно введите десять микролитров эмульсии в ткань. После инъекции всем животным наблюдайте за мышами до тех пор, пока они полностью не выздоровеют. Через три дня после иммунизации вазодилитируйте хвостовые вены животных, которым вводили инъекцию, как показано только что на рисунке.

После обезболивания обездвижите хвост первой мыши с помощью пары щипцов. Протрите хвост спиртовым тампоном, затем осторожно вставьте игольчатый катетер 30 с половиной калибра в боковую хвостовую вену, проверяя проходимость путем легкого надавливания на поршень шприца. Когда катетер будет на месте, нанесите одну-две капли цианоакрилатного тканевого клея на место инъекции и дайте клею высохнуть в течение примерно 30 секунд.

Затем с помощью ножниц аккуратно подстригите усы и волосы с тыльной и боковой стороны уха. Далее с помощью ватного тампона смочите внутреннюю поверхность уха PBS. Затем поверните мышь и прижмите введенное ухо к стеклянной крышке размером 24 на 50 миллиметров номер один целых пять десятых, пока оно не окажется на одном уровне со стеклом.

Промокните излишки PBS. Затем с помощью двух пар изогнутых щипцов захватите кусок тканевой ленты длиной примерно 20 миллиметров вдоль в верхних углах и поместите нижнюю часть ленты на покровную ленту в верхней части уха мыши. Наматывайте ленту на остальную часть уха, при необходимости отталкивая лишние волосы щипцами, и используйте сухой ватный тампон, чтобы аккуратно прижать ленту вокруг уха, чтобы обеспечить плотное прилегание, стараясь не давить на само ухо.

Важно, чтобы ухо было правильно приклеено к покровному листу с хорошим уплотнением с обеих сторон и с минимальным количеством пузырьков воздуха, так как это повлияет на качество получаемых изображений. Теперь прикрепите платформу для визуализации флуоресцентного микроскопа к нагревательному блоку с температурой 37 градусов Цельсия и нанесите вакуумную смазку на обе стороны области уха платформы. Поверните мышь, чтобы поместить чехол на платформу, стараясь выровнять ухо по центру войлока.

Когда ухо будет на месте, защелкните носовой конус изофлурана в держателе на платформе, убедившись, что конус надежно закреплен и полностью закрывает нос мыши. Затем с помощью ватной палочки сильно, но осторожно прижмите защитное стекло к платформе изображения, распределив вакуумную смазку под защитным стеклом. Оберните два куска по 20 мм и два более длинных куска ленты вокруг верхней части платформы, чтобы прикрепить чехол к платформе.

Далее переместите мышь на столик микроскопа. Закрепите платформу большим количеством скотча и нанесите двойной слой вакуумной смазки на крышку, прилегающую к уху. Затем оберните мышь наполненным водой нагревательным одеялом и наполните резервуар для вакуумной смазки дистиллированной водой с температурой 37 градусов Цельсия.

Для покадровой визуализации In vivo начните с расположения объектива над центром уха и опускайте объектив до тех пор, пока он не соприкоснется с поверхностью воды в резервуаре. Далее, используя внешний источник света, медленно опускайте объектив до тех пор, пока поверхность уха не окажется в фокусе. Затем опустите внутреннюю и внешнюю шторки вокруг предметного столика микроскопа и отрегулируйте длину волны лазера до 900 нанометров в окне контроллера лазера MP, мощность лазера в лазерном окне установки сбора данных и напряжение ФЭУ в окне управления получением изображений.

В окнах настроек размера и режима сбора данных установите разрешение микроскопа на пять двенадцать на пять двенадцать пикселей с временем выдержки в две микросекунды на пиксель и выберите повтор XY, чтобы активировать режим визуализации в реальном времени для сканирования ткани. После того, как соответствующее поле визуализации будет найдено, найдите самую высокую ячейку в дерме и нажмите кнопку «Установить ноль», чтобы установить положение Z равным нулю. Прокрутите вниз по оси Z, чтобы измерить глубину ячейки.

Затем установите начальное и конечное положения в окне установочного микроскопа и отрегулируйте напряжение ФЭУ прибора и мощность лазера в ярком окне Z для оптимизации визуализации ячеек по всей глубине поля визуализации. Проверьте кнопки глубины и времени и установите общий фильтр для сканирования изображения три раза на строку в окне режима фильтра управления получением изображения. Отрегулируйте глубину среза Z в окне микроскопа для получения изображений таким образом, чтобы захват полного стека занимал примерно одну минуту, как указано в окне временного просмотра.

Затем, чтобы оценить стабильность ткани, установите количество повторов равным пяти в окне сканирования настроек сканирования и нажмите кнопку сканирования, чтобы получить пятиминутное изображение области. Если ткань стабилизируется через пять минут, установите количество повторов в диапазоне от 30 до 45 в окне сканирования и соберите 30-45-минутное изображение с интервальной съемкой, отслеживая любой незначительный дрейф ткани по мере получения изображения. Сохраните изображение предварительного антитела в соответствующем формате, а затем наберите смесь антител в туберкулиновый шприц объемом один миллилитр, стараясь удалить все пузырьки воздуха.

Осторожно нажмите на поршень, чтобы раствор антитела образовал каплю на конце иглы, и поднимите занавес вокруг сцены, чтобы найти катетер. Замените шприц PBS на шприц с антителами, а затем медленно введите антитела в катетер. Когда антитела будут успешно введены, снова опустите шторы и отметьте время инъекции.

Затем немедленно начните собирать новую последовательность изображений за 20–40 минут в том же месте, используя те же настройки инструмента, что и изображение перед антителами. Наконец, сохраните файл изображения после антител в соответствующем формате и осторожно снимите мышь со сцены микроскопа, наблюдая за животным до его полного выздоровления. Визуализация интактной дермы уха с помощью этого протокола способствует получению изображений динамики эффекторных Т-клеток в воспаленной дерме с высоким разрешением и покадровой

В этом фильме можно наблюдать, как зеленые адоптивно перенесенные эффекторные Т-клетки перемещаются по всей кожной ткани. Однако после введения антибета-1 и антибета-3 энтогрин-блокирующих антител через катетер, ранее подвижные клетки останавливаются в дерме. Клетки демонстрируют снижение средней скорости после введения антител, а также значительное снижение их индекса меандрирования.

То есть отношение полного водоизмещения к общей длине гусеницы. Аутофлуоресцентные частицы из волосяных фолликулов, затенение и аутофлуоресцентные частицы из вышележащих волос, а также пузырьки воздуха, застрявшие между поверхностью уха и покровным слипом, могут привести к артефактам изображения, которые затрудняют визуализацию Т-клеток и мешают работе автоматизированного программного обеспечения для анализа изображений. Кроме того, использование нескольких источников тепла может вызвать проблемы со стабильностью тканей, что приводит к большим колебаниям во время визуализации, что затрудняет интерпретацию результатов.

После освоения визуализация CD4 Т-клеток в дерме может быть завершена за два-три часа, если процедура была выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о соблюдении соответствующих рекомендаций по уходу за животными и использованию рекомендаций по работе с мышами. Эта процедура может быть адаптирована для визуализации других подмножеств Т-клеток или типов иммунных клеток в ухе с использованием различных моделей инфекции или различных методов индуцирования воспаления.

После своего развития прижизненная визуализация открыла путь исследователям в области иммунологии к изучению динамики происходящих иммунных реакций у живых животных. Не забывайте, что работа с многолюминофорным лазером может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как надлежащее экранирование. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как вызвать воспаление в ушной дерме мыши, как использовать прижизненную визуализацию для получения покадровых изображений активности CD4 Т-клеток до и после введения антител.