Воображение CD4 Т-клеток Внутритканевая миграции в воспаленном дермы

Общая цель данного протокола визуализации заключается в наблюдении за динамикой CD4-положительных Т-клеток в воспаленной коже. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, такие как механизмы, лежащие в основе подвижности и функционирования иммунных клеток в воспаленных тканях. Основным преимуществом данной методики является то, что она обеспечивает минимально инвазивный способ изучения динамического поведения CD4 Т-клеток In Situ.

Визуальная демонстрация данного метода имеет критическое значение, так как этапы подготовки ушной раковины к визуализации сложно освоить, а для получения высококачественных изображений необходимо правильное позиционирование уха. Меня зовут Элисон Гейло, я аспирантка, и я проведу демонстрацию данного протокола. Начните с того, что наберите в шприц, оснащенный иглой калибра 27,5, 300 µL суспензии флуоресцентно меченных эффекторных Т-клеток на одну мышь.

Затем переверните шприц иглой вверх и осторожно постучите по корпусу шприца, при необходимости перемещая поршень вверх и вниз для удаления пузырьков воздуха. Когда клетки будут готовы, пересадите мышей в чистую клетку и поместите их под лампу для обогрева до расширения вен хвоста. Затем перенесите первую мышь в фиксатор и протрите хвост спиртовым тампоном.

После нахождения боковой хвостовой вены медленно введите 200 µL клеток в вену. Когда все клетки будут введены, наберите 50 µL полной флуоресцентной эмульсии в инсулиновый шприц с иглой 28,5 G и с силой нажмите на поршень, чтобы удалить крупные пузырьки воздуха. Затем наденьте на указательный палец левой руки напальчник и осторожно зажмите ухо мыши между левым большим пальцем и напальчником так, чтобы вентральная сторона уха была обращена вверх.

Затем введите иглу срезом вверх в дерму наружной трети ушной раковины, немного сместив ее от центра, и медленно введите десять микролитров эмульсии в ткань. После инъекции всем животным наблюдайте за мышами до их полного восстановления. Через три дня после иммунизации проведите вазодилатацию хвостовых вен инъекционных животных, как было продемонстрировано ранее.

После проведения анестезии зафиксируйте хвост первой мыши с помощью пинцета. Протрите хвост спиртовой салфеткой, затем осторожно введите игольчатый катетер калибра 30,5 в латеральную хвостовую вену, проверяя проходимость путем осторожного нажатия на поршень шприца. После установки катетера нанесите одну-две капли цианоакрилатного тканевого клея на место инъекции и дайте клею высохнуть в течение примерно 30 секунд.

Затем с помощью ножниц осторожно подрежьте вибриссы, а также шерсть на задней и боковых сторонах уха. Далее смочите внутреннюю поверхность уха раствором PBS с помощью ватного тампона. После этого поверните мышь и прижмите инъецированное ухо к стеклянному покровному стеклу номер 1,5 размером 24 на 50 мм так, чтобы оно плотно прилегало к стеклу.

Промокните излишки PBS. Затем с помощью двух пар изогнутых пинцетов захватите отрезок тканевой ленты длиной примерно 20 мм за верхние углы вдоль всей длины и приложите нижний край ленты к покровному стеклу в верхней части уха мыши. Накатайте ленту на остальную часть уха, при необходимости отодвигая лишние волоски пинцетом, и с помощью сухого ватного тампона аккуратно прижмите ленту по контуру уха для обеспечения плотного прилегания, стараясь не давить на само ухо.

Крайне важно правильно приклеить ухо к покровному стеклу, обеспечив надежное уплотнение с обеих сторон и минимальное количество пузырьков воздуха, так как это повлияет на качество получаемых изображений. Теперь закрепите платформу для визуализации на флуоресцентном микроскопе на нагревательном блоке с температурой 37 °C и нанесите вакуумную смазку на обе стороны области платформы, предназначенной для уха. Поверните мышь, чтобы поместить покровное стекло на платформу, стараясь расположить ухо в центре фетра.

После фиксации ушной раковины защелкните носовой конус для изофлурана в держателе на платформе, убедившись, что конус закреплен надежно и полностью закрывает нос мыши. Затем с помощью ватного тампона плотно, но осторожно прижмите покровное стекло к платформе для визуализации, равномерно распределяя вакуумную смазку под стеклом. Оберните верхнюю часть платформы двумя кусочками ленты длиной 20 мм и двумя более длинными кусочками ленты, чтобы зафиксировать покровное стекло на платформе.

Затем переместите мышь на предметный столик микроскопа. Более надежно закрепите платформу с помощью скотча и нанесите двойной слой вакуумной смазки на покровное стекло вокруг уха. Затем оберните мышь заполненным водой нагревательным одеялом и заполните резервуар с вакуумной смазкой дистиллированной водой с температурой 37 °C.

Для проведения In Vivo таймлапс-визуализации начните с позиционирования объектива над центром ушной раковины, затем опустите объектив до тех пор, пока он не коснется поверхности воды в резервуаре. Далее, используя внешний источник света, медленно опускайте объектив, пока поверхность ушной раковины не окажется в фокусе. Затем опустите внутренние и внешние шторы вокруг предметного столика микроскопа и установите длину волны лазера на 900 nm в окне контроллера MP-лазера, мощность лазера в окне настроек сбора данных (laser window) и напряжение на ФЭУ в окне управления сбором изображений.

В окнах настроек размера и режима сбора данных установите разрешение микроскопа 512 на 512 пикселей с временем задержки 2 µs на пиксель и выберите функцию XY repeat, чтобы активировать режим визуализации в реальном времени для сканирования ткани. После нахождения подходящего поля обзора определите самую верхнюю клетку в дерме и нажмите кнопку set zero, чтобы установить положение Z на ноль. Перемещайтесь вниз по оси Z, чтобы измерить глубину залегания клетки.

Затем установите начальное и конечное положения в окне настроек сбора данных микроскопа, а также отрегулируйте напряжение на ФЭУ прибора и мощность лазера в окне bright Z, чтобы оптимизировать визуализацию клеток по всей глубине поля сканирования. Отметьте галочками кнопки глубины и времени, и в окне режима управления фильтрами сбора изображений выберите общий фильтр для трехкратного сканирования каждой строки изображения. Отрегулируйте глубину Z-среза в окне микроскопа для сбора изображений таким образом, чтобы захват полного стека занимал примерно одну минуту, как указано в окне просмотра времени.

Затем, для оценки стабильности ткани, установите количество повторений на пять в окне настроек сбора данных для временного сканирования (time scan) и нажмите кнопку сканирования, чтобы получить серию изображений области с интервалом в пять минут. Если через пять минут ткань остается стабильной, установите количество повторений в диапазоне от 30 до 45 в окне настроек сбора данных для временного сканирования и получите серию изображений продолжительностью от 30 до 45 минут, контролируя возможный незначительный дрейф ткани в процессе съемки. Сохраните изображение, полученное до добавления антител, в соответствующем формате, после чего наберите смесь антител в туберкулиновый шприц объемом 1 мл, стараясь удалить все пузырьки воздуха.

Осторожно нажмите на поршень так, чтобы на конце иглы образовалась капля раствора антител, и поднимите шторки вокруг предметного столика, чтобы найти катетер. Замените шприц с PBS шприцем с антителами, после чего медленно введите антитела в катетер. После успешного введения антител снова опустите шторки и зафиксируйте время инъекции.

Затем немедленно начните сбор новой последовательности изображений длительностью от 20 до 40 минут в той же области, используя те же настройки прибора, что и при получении изображения до введения антител. В завершение сохраните файл изображения после введения антител в соответствующем формате и осторожно снимите мышь со столика микроскопа, наблюдая за животным до его полного восстановления. Визуализация неповрежденной дермы ушной раковины по данному протоколу позволяет получать изображения высокого разрешения и таймлапс-снимки динамики эффекторных Т-клеток в воспаленной дерме.

В этом видео можно наблюдать, как зеленые адаптивно перенесенные эффекторные T-клетки перемещаются по дермальной ткани. Однако после введения через катетер блокирующих антител к интегринам antibeta one и antibeta three ранее подвижные клетки останавливаются в дерме. После введения антител наблюдается снижение средней скорости клеток, а также значительное снижение их индекса извилистости.

То есть, отношение общего смещения к общей длине трека. Автофлуоресценция волосяных фолликулов, тени и автофлуоресценция перекрывающих волос, а также пузырьки воздуха, попавшие между поверхностью уха и покровным стеклом, могут приводить к возникновению артефактов изображения, которые затрудняют визуализацию T-клеток и создают помехи для работы программного обеспечения для автоматизированного анализа изображений. Кроме того, использование нескольких источников тепла может вызвать проблемы со стабильностью ткани, что приведет к сильным осцилляциям во время визуализации, затрудняющим интерпретацию результатов.

После освоения метода визуализация CD4 T-клеток в дерме может занять от двух до трех часов при условии правильного выполнения процедуры. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости соблюдения соответствующих правил по уходу за животными и их использованию при работе с мышами. Данный метод может быть адаптирован для визуализации других подмножеств T-клеток или типов иммунных клеток в ушной раковине с использованием различных моделей инфекции или разных способов индуцирования воспаления.

После своего появления интравитальная визуализация открыла перед исследователями в области иммунологии возможности по изучению динамики текущих иммунных ответов в живых животных. Помните, что работа с многофосфорным лазером может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении данной процедуры всегда необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как использование надлежащего экранирования. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как индуцировать воспаление в дерме уха мыши, а также о том, как использовать интравитальную визуализацию для получения серии изображений во времени (time-lapse), отражающих активность CD4 T-клеток до и после введения антител.