Создание "гуманизированные" Drosophila S2 клеточной линии Чувствительные к фармакологическим ингибирование Kinesin-5

Общая цель этого эксперимента заключается в создании клеточной линии Drosophila S2, чувствительной к низкомолекулярным ингибиторам мотора кинезин-5, чтобы их можно было использовать для изучения коррекции ошибок. Коррекция ошибок во время деления клетки — это процесс, при котором ошибочные взаимодействия кинетохора и микротрубочек дестабилизируются, чтобы дать клетке второй шанс или еще одну возможность сформировать правильные прикрепления, чтобы затем геном мог быть должным образом разделен. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, связанные с процессом исправления ошибок.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем использовать клеточную линию дрозофилы S2, которая имеет меньше хромосом и чувствительна к ингибитору кинезина-5, что облегчает визуализацию отдельных событий коррекции ошибок. Начиная с предварительно культивированной 25-сантиметровой квадратной колбы 100% конфлюентного GFP-альфа-тубулина, экспрессирующего S2-клетки, перенесите два миллилитра культуры в 35-миллиметровую чашку. Затем инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение примерно одного часа, чтобы они частично прилипли.

Выньте среду из чашки и добавьте один миллилитр среды Шнайдера, дополненной FBS, в два микрограмма конструкции Eg5-mCherry и реагента для трансфекции клеток в соответствии с протоколом производителя. Используйте парапленку, чтобы запечатать чашку, и инкубируйте клетки при температуре 25 градусов Цельсия в течение 16-18 часов. Затем добавьте один миллилитр среды Шнайдера и верните клетки в инкубатор

На третий день после трансфекции перенесите 500 микролитров трансфицированных клеток в новую 35-миллиметровую чашку для культуры тканей, содержащую 1,5 миллилитров среды Шнайдера для тестовой индукции. Чтобы вызвать экспрессию Eg5-mCherry, добавьте сульфат меди до конечной концентрации 500 микромоляров. Запечатайте блюдо в парапленку и выдерживайте при температуре 25 градусов Цельсия в течение ночи.

Поместите заранее подготовленную крышку Concanavalin размером 22 на 22 миллиметра в чистую 35-миллиметровую чашку для культуры тканей. Затем засейте 500 микролитров 100% слитых индуцированных клеток на покровный лист и дайте клеткам прилипнуть при комнатной температуре. Чтобы проверить экспрессию Eg5-mCherry, соберите крышку в розовую камеру со средой и изображением при комнатной температуре с помощью флуоресцентного микроскопа, в соответствии с рекомендациями в текстовом протоколе.

Убедившись, что клетки экспрессируют как Eg5-mCherry, так и альфа-тубулин GFP, перенесите оставшуюся часть трансфицированных, неиндуцированных клеток в 25-сантиметровую квадратную колбу для культуры тканей, содержащую четыре миллилитра среды Шнайдера. Добавьте бластицидин S HCL в конечной концентрации 25 мкг на миллилитр в колбу и продолжайте расщепление клеток в присутствии бластицидина S HCL до тех пор, пока не прекратится гибель клеток. После получения двухцепочечной РНК KLP61F в соответствии с текстовым протоколом, высейте клетки S2, экспрессирующие Eg5-mCherry, в 35-миллиметровую чашку для культуры при конфлюенции 25% и дайте им прилипнуть в течение одного часа.

Уберите среду из посуды и добавьте один миллилитр бессывороточной среды Schneider's к пяти микрограммам двухцепочечной РНК KLP61F. После инкубации при комнатной температуре в течение одного часа добавьте один миллилитр среды Шнайдера с 10% FBS. Инкубируйте клетки при температуре 25 градусов Цельсия.

24 часа после обработки дцРНК индуцируйте экспрессию Eg5-mCherry путем добавления сульфата меди до конечной концентрации 500 микромоляров. Инкубируйте клетки при температуре 25 градусов Цельсия еще 24 часа. Чтобы провести визуализацию живых клеток, поместите покрытую крышку Concanavalin A размером 22 на 22 мм в чистую чашку для культуры тканей размером 35 мм.

Засейте 500 микролитров обработанных дцРНК клеток, которые были индуцированы в течение ночи, на покровный лист и дайте им прилипнуть в течение примерно одного часа. После сбора покадровых изображений биполярных шпинделей в соответствии с текстовым протоколом, удалите среду из розовой камеры и добавьте среду Шнайдера, содержащую один микромолярный STLC, и замените среду STLC еще два раза, отбрасывая среду после каждой промывки для визуализации разрушения веретена. Чтобы вымыть препарат и обратить вспять коллапс веретена, осторожно удалите среду, содержащую STLC, из розовой камеры и выбросьте ее в контейнер для отходов, а затем используйте от 6 до 8 миллиметров среды Шнайдера для промывания клеток четыре раза, выбрасывая среду после каждой промывки.

Затем, добавив свежую среду для пополнения камеры, продолжайте визуализацию. Чтобы получить доступ к средству для промывки и вымывания препарата, осторожно снимите верхнюю крышку стекло с розовой камеры, закрепив ее на микроскопе. В качестве альтернативы для визуализации живых клеток можно использовать чашку Петри со стеклянным дном, обработанную Конканавалином А, аналогично покровным листам.

После посева 500 микролитров клеток S2, обработанных дцРНК KLP61F, на покровный лист Конканавалина А и предоставления клеткам возможности прилипнуть, добавьте 1,5 миллилитра среды Шнайдера, чтобы довести окончательный объем до двух миллилитров. После того, как клетки были остановлены в митозе в соответствии с текстовым протоколом, добавьте один микромолярный STLC и инкубируйте в течение одного часа, чтобы дать возможность сформироваться монополям. Промойте STLC, используя два миллилитра свежей среды Schneider, чтобы прополоскать покровные стекла три раза.

Чтобы зафиксировать клетки в разных временных точках формирования биполярного веретена, а также оценить места прикрепления кинетохора, начните с использования двух миллилитров 1X BRB80 для быстрого промывания покровных стеблей. В химическую вытяжку добавьте два миллилитра 10% PFA в 1X BRB80 и выдерживайте в течение 10 минут. Далее, чтобы проникнуть в клетки, добавьте 1% Triton X в 1X PBS и инкубируйте в течение 10 минут.

Затем используйте два миллилитра 0,1% Triton X в 1X PBS, чтобы промыть клетки три раза. Затем перенесите защитный лист стороной ячейки вверх на лист парапленки в 150-миллиметровой чашке Петри. Добавьте 150 микролитров кипяченой ослиной сыворотки (BDS) в покровные листы и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы блокировать связывание неспецифических антител.

После инкубации снимите блок и добавьте 150 микролитров первичных антител, приготовленных по текстовому протоколу, перед инкубацией при комнатной температуре в течение одного часа. После трехкратной стирки чехлов добавьте фторо-4 конъюгированные вторичные антитела, разведенные в BDS, и инкубируйте при комнатной температуре от 30 до 60 минут. После того, как покровные стекла были промыты три раза, инкубируйте их со 150 микролитрами BDS, содержащими один микрограмм на миллилитр DAPI, в течение пяти минут.

Затем, после того, как защитные стекла будут промыты дважды, используйте восемь микролитров монтажной среды, чтобы установить образец клеточной стороной вниз на предметное стекло размером три на один дюйм. С помощью лака для ногтей покрасьте углы. Наконец, используйте объектив 100X для изображения клеток с биполярными веретенами, экспрессирующими Eg5-mCherry.

Возьмем серию Z, состоящую из 30 плоскостей с интервалом 0,2 микрометра во всех каналах. Тщательно проанализируйте кинетохор и микротрубочки, чтобы определить состояние прикрепления. KLP61F необходим для формирования биполярных веретен в клетках Drosophila S2; однако низкомолекулярные ингибиторы кинезина-5 неэффективны против него.

Эти изображения показывают, что человеческий кинезин-5 Eg5 может восстановить функцию KLP61F в клетках дрозофилы S2. При добавлении ингибитора кинезина-5, STLC, связанные с микротрубочками, уровни мотора падают, и веретено разрушается, что приводит к образованию монополя в клетках, лишенных эндогенного KLP61F в результате успешной РНК I. Этот рисунок демонстрирует, что ингибирование кинезина-5 может быть обращено вспять путем вымывания препарата, а восстановление биполярного веретена может наблюдаться с течением времени. После удаления ингибитора Eg5-mCherry реассоциируется с микротрубочками, и клетки могут прогрессировать в биполярную анафазу.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создать клеточную линию дрозофилы S2, чувствительную к низкомолекулярному ингибитору кинезина-5. После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за шесть часов, если она выполнена правильно. Пробуя эту процедуру, важно планировать заранее, потому что этот метод требует подготовки за несколько дней.

Не забывайте, что работа с низкомолекулярными ингибиторами может быть опасной, поэтому всегда надевайте перчатки. Создание гуманизированных клеток плодовой мухи может быть доказано за счет применения технологий Crispr-Cas 9 и замены кинезина дрозофилы-5 его человеческим аналогом. Создание гуманизированных клеток дрозофилы должно улучшить наше понимание коррекции ошибок и других важных клеточных процессов в будущем.