Отслеживание клеток в GFP-трансгенной данио рерио Использование системы Photoconvertible PSmOrange
5 февраля 2016 г.
Мы создали фотоконвертируемую систему PSmOrange как мощный, простой и недорогой инструмент для отслеживания клеток in vivo в трансгенных фонах GFP. Этот протокол описывает его применение в модельной системе рыбок данио.
Общая цель технологии преобразования фотографий PSmOrange заключается в отслеживании клеток в живом животном во время эмбрионального развития и болезни. Этот метод может ответить на ключевые вопросы биологии развития, такие как раскрытие происхождения клеток, которые развиваются в ткани и органы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть применена на трансгенных фонах GFP.
Этот метод также может быть применен в различных областях исследований, таких как регенерация, прогрессирование опухоли и инвазия. После создания и встраивания эмбрионов, экспрессирующих PSmOrange и GFP в соответствии с текстовым протоколом, поместите эмбрион под конфокальный микроскоп и используйте 20-кратный воздушный объектив и лазеры 488 и 561 нанометров для сканирования образца, чтобы определить область для фотоконвертации. Чтобы обнаружить белок PSmOrange перед фотоконверсией, используйте лазер с яркостью 561 нанометр и мощностью 0,74 милливатт, измеренной в плоскости фокусировки над объективом, и при необходимости отрегулируйте мощность лазера.
Отрегулируйте коэффициенты масштабирования, чтобы выделить интересующую область и сократить время получения изображения и его токсичность. Используя лазеры 488 и 561 нанометров в последовательном режиме и с шагом Z между 1,0 и 2,0 микрометрами, получить стек Z, охватывающий интересующие структуры. Отрегулируйте среднее значение линии и частоту сканирования для оптимизации качества изображения.
Затем отсканируйте образец и выберите интересующую область, или инструмент ROI, чтобы выделить область для фотопреобразования, прежде чем зафиксировать ROI в качестве области стимуляции. Выберите модуль фотоактивационного отбеливания, установите флажок для активации лазера 488 нм, затем установите лазер 488 нм на 80% и скорость сканирования 0,5 секунды на кадр. Далее откройте утилиту фотоконвертации и нажмите на кнопку Добавить, чтобы указать протокол фотоконвертации.
В меню стимуляции сбора данных установите для параметра Первая фаза значение сбора данных, а в меню циклов укажите количество изображений, которые должны быть получены до фотопреобразования. Установите для параметра Фаза 2 значение стимуляции и введите количество событий стимуляции, которые должны быть выполнены. Отрегулируйте третью фазу, как описано для первой фазы.
При необходимости вставьте фазу ожидания после второй фазы, указав время ожидания перед последним раундом получения изображения. После того, как параметры заданы, примените настройку стимуляции и запустите фотоконвертацию. Некроскопические настройки имеют решающее значение для фотопреобразования PSmOrange.
Чтобы обеспечить успешную фотоконверсию, эмбрион визуализируют сразу после эксперимента для обнаружения фотопреобразованного белка PSmOrange. Если конвертация не увенчалась успехом, процедуру повторяют. Используя лазеры 488, 561 и 640 нанометров, а также настроив 640-нанометровый лазер на высокую мощность, до 4,5 милливатт, получите окончательный стек z с только что описанными настройками.
Чтобы извлечь эмбрион, извлеките камеру из микроскопа и с помощью щипцов извлеките эмбрион из агарозы. Перенесите эмбрион в новую стерилизованную пластиковую чашку Петри или стерилизованную 6-луночную тарелку, содержащую 0,2 миллимоляра ПТУ в Е3. Инкубируйте эмбрион при температуре 28 градусов Цельсия до нужной стадии развития. Для анализа судьбы фотоконвертированных клеток, экспрессирующих белок PSmOrange, повторно встраивают эмбрион в соответствии с текстовым протоколом.
Под конфокальным мискроскопом отсканируйте образец, чтобы идентифицировать фотоконвертированные клетки в представляющей интерес трансгенной структуре GFP. Используйте лазеры длиной 488, 561 и 640 нанометров для получения стека z с фиксированным стеком от 1 до 2 микрометров в последовательном режиме, охватывающем структуры. С помощью программного обеспечения Image J Fiji определите клетки, которые совместно экспрессируют GFP и фотопреобразованный белок.
Скопируйте исходный стек, используйте плагин Gaussian Blur и калькулятор изображений, чтобы вычесть плавные стеки из оригинала. Примените определенные пороговые значения к зеленому и дальнему красным каналам, чтобы выделить фотопреобразованные ячейки. Затем используйте инструмент «Анализ частиц», чтобы обнаружить пороговые области в зеленом канале с подходящими настройками.
Повторите этот шаг для дальнего красного канала. Откройте плагин калькулятора изображений, чтобы обнаружить совпадающие ячейки. Отобразите желтым цветом перекрывающиеся ROI в зеленом или дальнем красном канале с помощью инструмента «Анализ частиц».
С помощью программного обеспечения NIS-Elements выполните 3D-оценку даты и отобразите стек в 3D с помощью опции «Показать объемный вид». Затем с помощью графического интерфейса выберите зеленый, красный и дальний красный каналы, отрегулируйте яркость и контрастность и обрежьте 3D-стек, чтобы выделить фотопреобразованную область. Здесь показан пример фотоковерсионной системы PSmOrange на эмбрионах GFP с плавающей головой GFP рыбы данио-рерио.
Через 26 часов после оплодотворения два кластера клеток в передней части шишковидной железы были фотоконвертированы и немедленно визуализированы. Белок был обнаружен с помощью 640-нанометрового дальнего красного лазера, но не с помощью 561-нанометрового лазера. В этих клетках экспрессия GFP первоначально была снижена из-за фотообесцвечивания.
При 52 HPF, GFP и H2B PSmOrange были обнаружены в фотоконвертированных клетках, экспрессирующих белок H2B PSmOrange. Некоторые из этих клеток образовали парапинеальную мышцу в левой части мозга. Этот результат согласуется с предыдущими сообщениями о происхождении парапинеальных клеток в передней шишковидной кости и показывает применимость метода PSmOrange к живому эмбриону трансгенного позвоночного GFP.
После этой процедуры можно провести анализ отслеживания клеток генетически модифицированных эмбрионов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся молекулярной иерархии, лежащей в основе развития клетки.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Система PSmOrange представляет собой экономически эффективный инструмент для отслеживания клеток in vivo на фоне GFP-трансгенных линий, в частности, в моделях на данио-рерио. Данный протокол облегчает изучение происхождения клеток в процессе эмбрионального развития и развития заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология развития
- Трекинг клеток
- Эмбриональное развитие
Теоретические основы
- Технология фотоконверсии PSmOrange позволяет отслеживать клетки в живых организмах.
- Данный метод применим в различных областях исследований, включая регенерацию и прогрессирование опухолей.
- Метод может быть использован на трансгенных фонах с GFP, что расширяет возможности его применения.
- Для визуализации и фотоконверсии клеток применяется конфокальная микроскопия.
Цель исследования
- Для отслеживания клеток в процессе эмбрионального развития и при патологических процессах.
- Для выявления происхождения клеток, которые развиваются в ткани и органы.
- Для изучения поведения клеток в различных биологических контекстах.
Используемые методы
- Получение эмбрионов, экспрессирующих PSmOrange и GFP.
- Встраивание эмбрионов в гель для анализа методом конфокальной микроскопии.
- Использование лазеров с длиной волны 488 и 561 nm для визуализации.
- Фотоконверсия белка PSmOrange для целей отслеживания.
Основные результаты
- Успешное отслеживание клеток в моделях zebrafish с использованием системы PSmOrange.
- Продемонстрированная возможность визуализации происхождения и поведения клеток.
- Подчеркнута применимость данного метода в различных областях биологических исследований.
- Представлен простой и понятный протокол для использования исследователями.
Выводы
- Система PSmOrange является эффективным инструментом для отслеживания клеток in vivo.
- Она дает значительные преимущества при изучении биологии развития.
- Данный метод позволяет углубить понимание сложных биологических процессов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Система фотоконвертируемого белка PSmOrange позволяет осуществлять точное отслеживание клеток in vivo в эмбрионах трансгенных рыб данио-рерио, экспрессирующих GFP, что решает ключевую проблему исследований в области биологии развития, где существующим трансгенным линиям не хватает совместимых репортеров для анализа клеточных линий. Эта возможность способствует механистическому снижению рисков при валидации мишеней, позволяя напрямую визуализировать происхождение клеток и решения об их судьбе в системах, имеющих значение для изучения заболеваний, особенно в приложениях онкологии и регенеративной медицины, касающихся прогрессирования опухоли, инвазии и регенерации тканей. Данный метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей, предоставляя количественные пространственно-разрешенные данные о миграции и дифференцировке клеток в целостных живых организмах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем отслеживания определенных популяций клеток на трансгенных фонах для выяснения клеточного происхождения тканей и органов.
- Практическая ценность: совместимость с существующими трансгенными линиями GFP, что устраняет необходимость создания новых промоторов и сокращает время разработки модели.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет прямого наблюдения за судьбой клеток, что повышает уверенность в ассоциациях между мишенью и механизмом заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные пространственные и временные данные о миграции фотоконвертированных клеток, что обеспечивает объективное сравнение генетических или фармакологических воздействий.
- Практическая ценность: метод основан на стандартной конфокальной микроскопии с последовательным лазерным возбуждением (488, 561, 640 nm) и не требует специализированного оборудования, выходящего за рамки обычных центров визуализации.
- Масштабируемость: совместимость с 3D-визуализацией высокого разрешения и инструментами постобработки (ImageJ Fiji, NIS-Elements) для воспроизводимого анализа колокализации с GFP.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: метод напрямую применим для изучения инвазии опухолевых клеток и моделей метастазирования в ксенографтах или трансгенных моделях рака у зебрафишей.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает плавный переход от этапа открытия (отслеживание происхождения клеток) к доклинической валидации путем мониторинга приживления, миграции и интеграции фотоконвертированных клеток in vivo.
- Принятие решений с учетом рисков: предоставляет визуальные и количественные конечные точки для принятия решений о продолжении или прекращении (go/no-go) ранних этапов доклинической разработки на основе поведения клеток в контексте соответствующего заболевания.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Система PSmOrange вписывается в континуум от раннего поиска до доклинических исследований, служа инструментом фенотипического скрининга и механистической валидации, который связывает генетические манипуляции с функциональными клеточными показателями в живых моделях позвоночных.
- Биологические исследования: Обеспечивает проверку гипотез, позволяя осуществлять картирование судьбы конкретных популяций клеток в ответ на генетические или средовые воздействия в трансгенных эмбрионах GFP.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые количественные результаты (процент колокализации, расстояние миграции), подходящие для скрининга соединений или генетических супрессоров/энхансеров.
- Аналитика: Позволяет получать многоканальные данные флуоресценции (GFP, оранжевый/красный PSmOrange, дальний красный фотоконвертированный PSmOrange), что обеспечивает строгий анализ колокализации и частиц для объективного фенотипирования.
- Трансляционные исследования: Связывают метод с доклинической работой путем отслеживания поведения клеток в моделях регенерации и прогрессирования опухолей, что позволяет подтвердить механистическую валидность мишеней.
- Повторное использование в рамках предприятия: Представляет собой универсальный функционал платформы; инъекция мРНК позволяет быстро внедрять метод в нескольких трансгенных линиях без создания новых стабильных штаммов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней, предоставляя прямые визуальные доказательства клеточной динамики в неповрежденных организмах.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию между лабораториями за счет определенных протоколов фотоконверсии и настроек лазера (488 nm при 80% мощности, 0,5 sec/frame; 640 nm до 4,5 mW для детекции).
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет использования существующих GFP-трансгенных ресурсов, позволяя избежать дорогостоящей идентификации промоторов de novo и создания новых линий.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков, предоставляя ранние функциональные данные in vivo о поведении клеток, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях из-за непредвиденной биологической сложности.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт работы с конфокальной микроскопией, методами фотоконверсии и спектральным разделением флуоресценции.
- Зависит от доступа к лазерным сканирующим конфокальным системам с лазерами 488, 561 и 640 nm и соответствующими наборами фильтров.
- Для получения воспроизводимых результатов необходима стандартизация выбора ROI, мощности лазера, скорости сканирования и параметров z-стека для всех пользователей.
- Адаптация метода для видов неостроконечных телеостей может потребовать оптимизации дозировки мРНК и эффективности фотоконверсии.
- Практическое ограничение: эффективность фотоконверсии зависит от уровней экспрессии белка и доступности целевых клеток для проникновения лазера в более толстых тканях.
