Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии
30 января 2016 г.
Мы представляем протокол о том, как использовать высокой пропускной крио-электронной томографии для определения высокого разрешения в точке, структур молекулярных машин. Протокол позволяет большие объемы данных, подлежащих обработке, избегает общих узких мест и сокращает время простоя ресурсов, позволяя пользователю сосредоточиться на важных биологических вопросов.
Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы помочь пользователям создать высокопроизводительный конвейер сбора и обработки данных криоэлектронной томографии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области криоэлектронной томорографии, такие как: как обрабатывать данные, собранные с помощью детекторов нового поколения, и обрабатывать огромное количество данных, полученных с помощью автоматизированного программного обеспечения для сбора данных tilt-серии? Основное преимущество этого метода заключается в том, что пользователь может объединить несколько программных пакетов, чтобы найти эффективный конвейер для автоматизированной обработки наклонных серий, что позволяет тратить больше времени на анализ томограмм
.Как правило, люди, плохо знакомые с крио-ЭТ, испытывают трудности, потому что для обработки больших объемов данных, полученных с помощью электронного микроскопа, требуется множество утомительных шагов. Идея этой разработки пришла нам в голову пять лет назад, когда нам пришлось вручную пройти сотни этапов, чтобы получить 3D-реконструкцию одной бактерии. Заранее ознакомьтесь с текстовым протоколом по приготовлению мини-ячеек Shigella flexneri.
Затем подготовьте сетки электронной микроскопии, как описано в существующей публикации JoVE, а также задокументировано в текстовом протоколе. После загрузки ЭМ-столика коллекцией мини-ячеек, встроенных в остеклованный лед, приступайте к сбору карт с малым увеличением для серии наклонов. При просмотре флуоресцентного экрана при малом увеличении, около 2300x, найдите квадраты сетки, которые приемлемы для изображения.
Это место должно содержать тонкий лед и объект интереса без загрязнений. Затем настройте вид на центр квадрата сетки и нажмите на кнопку «Добавить положение рабочей области», чтобы сохранить местоположение. Затем повторяйте процесс до тех пор, пока все допустимые квадраты сетки не сохранят свое местоположение.
Следующий шаг начинается с открытия нового файла монтажа. В диалоговом окне настройки установите значения X и Y так, чтобы был захвачен весь квадрат сетки. Для стандартной сетки размером 200 меш создайте пространство 10 на 10 с высоким значением Binning, например, восемь.
Также включите опцию перемещения рабочей области вместо смещения изображения и опцию пропуска корреляций, используемых для выравнивания фигур. Теперь в окне «Навигатор» выберите первую позицию этапа, которую необходимо получить, с помощью переключателя «Получить». Продолжайте делать это для каждой позиции этапа.
Затем в меню «Навигатор» нажмите «Получить в точках». В открывшемся диалоговом окне переключите получение изображения карты и грубую евцентриситетность. Отключите все остальные параметры.
Затем нажмите «Продолжить», и для каждой позиции сцены будет сделан монтаж. Продолжайте работу с программным обеспечением SerialEM. В Навигаторе выберите полученные карты, и нажмите на кнопку Загрузить карту.
Затем нажмите «Добавить точки» и выберите точки на карте, где должен быть получен наклонный ряд. После выбора нажмите «Остановить добавление точек» и повторите процесс с каждой собранной картой. Далее откройте параметры в меню «Камера» и установите режимы «Фокус», «Проба» и «Запись».
Опция записи данных по дозированному фракционированию может представлять особый интерес, и ее можно указать в опциях Запись. Чтобы продолжить, выберите одну из точек на текущей карте и переключите опцию наклона в окне Навигатор. В открывшемся диалоговом окне выберите параметры для tilt-series.
Затем повторите процесс переключения опции tilt-series для каждой из выбранных точек на карте. Далее из Навигатора запускаем опцию Приобретать в точках. В диалоговом окне переключите следующие параметры: Предварительные задачи, Выровнять по элементу, Автофокус и Грубая эуцентричность.
Затем установите Основную задачу для получения tilt-series, и выберите Закрыть валы столбца в конце, чтобы закрыть столбец, когда все точки будут собраны. Когда процесс будет выполнен, в каждой точке будет собрана серия наклонов, которая будет переключаться на коллекцию серий наклонов на каждой карте. С помощью оригинальной серии наклонов, журнала вывода из SerialEM и отдельных изображений с дозированием в текущем рабочем каталоге терминала выполните следующую команду, чтобы удалить артефакт движения, вызванного лучом.
Приступайте к выравниванию и восстановлению ряда наклонов. Введите в терминале команду tomoauto следующим образом. К команде добавьте имя файла tilt-series to process, а затем реперный диаметр в нанометрах.
Если обработка CTF нежелательна, просто исключите эту опцию из команды. Эта команда является основным использованием tomoauto, позволяя пользователям выполнять все процессы, связанные с выравниванием наклонного ряда, которые первоначально требовали ручного вмешательства пользователя, в одной команде, что позволяет пользователям быстро создавать сценарии пакетной обработки. Теперь, используя команду 3dmod, просмотрите выровненный ряд наклонов на наличие явных ошибок.
Здесь filename - это название tilt-серии без суффикса. Затем проверьте предполагаемый CTF с помощью команды, показанной здесь. Опять же, filename - это название серии tilt без суффикса.
Кроме того, в журнале вывода, созданном командой tomoauto, проверьте остаточную ошибку выравнивания. Это количественная мера общего качества выравнивания. Если выравнивание приемлемо, то приступайте к расчету реконструкции.
Эта команда установлена для коррекции CTF и удаления реперных маркеров, используемых при выравнивании, из tilt-ряда. Чтобы пропустить визуальный осмотр, а перейти непосредственно к реконструкции, воспользуйтесь этой командой. У Tomoauto есть много доступных вариантов.
Одним из них, в частности, является возможность включения локальных конфигураций, описанных вспомогательным файлом, согласно документации tomoauto. Включите имя этого файла в диалоговое окно командной строки, используя параметр локальной конфигурации, прежде чем добавлять имя файла tilt-series. Возможность создания локальных конфигурационных файлов является самой мощной функцией tomoauto, позволяющей пользователям полностью настраивать каждую используемую команду, настраивая выполнение на конкретные или сложные наборы данных, сохраняя при этом автоматическую обработку.
В протокол тестирования включены дополнительные инструкции по выполнению усреднения субтомограммы. Следуя описанным протоколам, с помощью tomoauto были изготовлены две выровненные наклонные серии. Точное выравнивание вычисляется на основе модели, которая идеально определяет координаты реперного маркера.
Под углом50 градусов одна серия tilt-series правильно отслеживала золотые частицы, указывая на приемлемое выравнивание. В то время как в случае со второй серией наклона несколько точек модели, показанных красным цветом, отклонились от соответствующего золотого маркера, иллюстрирующие модель, не дали подходящего выравнивания. При сборе наклонных серий tomoauto успешно выравнивает от 80 до 90% собранных наклонных серий.
После реконструкции финальная томограмма представляет собой 3D объем образца изображения. Затем это может быть использовано для клеточной аннотации путем сегментации или усреднения субтомограммы для получения информации о молекулярном механизме с более высоким разрешением в образце. Среднее значение субтомограммы в 2,7 нанометра для прикрепленной Shigella flexneri, нанесенной в EMDB, показывает значительное улучшение этого метода по сравнению с просмотром инъекции на одной томограмме.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как собирать и обрабатывать данные криоэлектронной томографии с помощью SerialEM и tomoauto автоматизированным и высокопроизводительным способом. После освоения этой техники можно собрать почти 100 тилт-серий за день, если она выполнена правильно, и выровнять тилт-серию за 20 минут. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что всегда нужно проверять качество выравнивания серии наклонов.
Если набор наклонных серий не выравнивается, попробуйте выполнить выравнивание вручную и перенесите параметры в локальную конфигурацию. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как усреднение субтомограммы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как определение структуры макромолекулярных комплексов с более высоким разрешением. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области крио-ЭМ для изучения структур in situ с высоким разрешением у бактерий, вирусов и других организмов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается высокопроизводительный метод криоэлектронной томографии для определения структур молекулярных машин in situ с высоким разрешением. Метод оптимизирует обработку данных, сводит к минимуму возникновение узких мест и сокращает время простоя ресурсов, позволяя исследователям сосредоточиться на решении важных биологических задач.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Криоэлектронная томография
- Молекулярная биология
- Структурная биология
Теоретическая часть
- Высокопроизводительный конвейер сбора и обработки данных для криоэлектронной томографии.
- Проблемы при работе с данными, полученными с детекторов нового поколения.
- Необходимость эффективной обработки больших наборов данных, полученных при автоматизированном сборе серий наклонов.
- Исторический контекст ручной обработки данных в крио-ЭТ.
Цель исследования
- Разработка оптимизированного протокола криоэлектронной томографии.
- Обеспечение автоматизированной обработки данных серий наклонов.
- Повышение эффективности анализа томограмм.
Используемые методы
- Протокол высокопроизводительной криоэлектронной томографии.
- Конфигурация нескольких программных пакетов для обработки данных.
- Методы автоматизированного сбора серий наклонов.
- Подготовка миниклеток Shigella flexneri для анализа.
Основные результаты
- Сокращение количества трудоемких этапов обработки данных.
- Повышение эффективности обработки больших наборов данных.
- Усиление внимания к биологическим вопросам за счет оптимизации рабочего процесса.
- Успешное применение протокола для создания 3D-реконструкций.
Выводы
- Данный протокол значительно упрощает процесс криоэлектронной томографии.
- Он позволяет исследователям уделять больше времени анализу, а не обработке данных.
- Будущее применение этого метода может способствовать более глубокому пониманию работы молекулярных машин.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Высокопроизводительная криоэлектронная томография устраняет узкое место в обработке данных структурной биологии, обеспечивая быстрое получение 3D-моделей макромолекулярных комплексов в нативном клеточном контексте. Благодаря автоматизации сбора и выравнивания серий наклонов, данный метод сокращает необходимость ручного вмешательства и ускоряет рабочие процессы валидации мишеней на ранних этапах исследований. Это повышает прогностическую уверенность при снижении рисков в механистических исследованиях программ по поиску антимикробных мишеней и мишеней факторов вирулентности.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Обеспечивает визуализацию интактных макромолекулярных комплексов, таких как системы секреции III типа, в состояниях, близких к нативным, для функционального исследования мишеней.
- Практическая ценность: Сокращает время, затрачиваемое на ручную обработку данных, позволяя ученым сосредоточиться на проверке биологических гипотез, а не на устранении узких мест при обработке информации.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: получение усредненных субтомограмм, которые повышают контраст и разрешение для надежного структурного фенотипирования мишеней лекарственных препаратов.
- Практическая ценность: стандартизация сбора и обработки данных с помощью tomoauto, что обеспечивает воспроизводимость результатов при работе с большими наборами данных для подготовки к анализу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает 3D-реконструкции с разрешением ~2,7 nm для углубления понимания механизмов функционирования комплексов вирулентности в биологических системах, имеющих значение для развития заболеваний.
- Практическая ценность: Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации путем получения количественных структурных данных для определения приоритетности мишеней.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс разработки лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации ведущего соединения — обеспечивая получение структурных данных высокого разрешения о макромолекулярных комплексах in situ.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей за счет визуализации макромолекулярных ансамблей в нативной клеточной среде.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию анализа с помощью автоматизированной обработки серий наклонов и количественных показателей качества выравнивания.
- Аналитика: предоставляет измерения остаточной ошибки из лог-файлов вывода tomoauto в качестве объективных индикаторов качества выравнивания для принятия решений на основе данных.
- Трансляционные исследования: связывает структурные данные с доклиническими разработками путем разрешения комплексов в мутантных или кондиционированных состояниях для структурно-ориентированного дизайна.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемый настраиваемый конвейер с помощью локальных конфигурационных файлов в tomoauto для согласованного применения к различным мишеням и наборам данных.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней, сокращая механистическую неопределенность за счет получения изображений in situ с высоким разрешением.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость, позволяя получать почти 100 серий наклонов в день с выравниванием примерно за 20 минут на серию.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя надежные структурные данные на ранних этапах процесса поиска, что снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе разрешимых структурных состояний и сложной динамики.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области криоэлектронной микроскопии, работы с SerialEM и обработки данных в командной строке tomoauto.
- Необходим крио-ПЭМ с ускоряющим напряжением 300kV, камерой прямого детектирования и вычислительная инфраструктура для выравнивания и реконструкции серий наклонов.
- Требуется межкомандная стандартизация подготовки сеток, именования данных и локальных конфигурационных файлов для обеспечения единообразия обработки.
- Необходимо учитывать особенности адаптации к различной толщине льда, загрязнению образцов и маркировке фидуциальными маркерами для разных модельных систем.
- Существуют практические ограничения, такие как вероятность успешного выравнивания 80–90% для собранных серий наклонов, что требует ручного исправления в неудачных случаях.
