Использование Tomoauto: протокол для высокой пропускной автоматизированной Cryo-электронной томографии

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы помочь пользователям создать высокопроизводительный конвейер сбора и обработки данных криоэлектронной томографии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области криоэлектронной томорографии, такие как: как обрабатывать данные, собранные с помощью детекторов нового поколения, и обрабатывать огромное количество данных, полученных с помощью автоматизированного программного обеспечения для сбора данных tilt-серии? Основное преимущество этого метода заключается в том, что пользователь может объединить несколько программных пакетов, чтобы найти эффективный конвейер для автоматизированной обработки наклонных серий, что позволяет тратить больше времени на анализ томограмм

Как правило, люди, плохо знакомые с крио-ЭТ, испытывают трудности, потому что для обработки больших объемов данных, полученных с помощью электронного микроскопа, требуется множество утомительных шагов. Идея этой разработки пришла нам в голову пять лет назад, когда нам пришлось вручную пройти сотни этапов, чтобы получить 3D-реконструкцию одной бактерии. Заранее ознакомьтесь с текстовым протоколом по приготовлению мини-ячеек Shigella flexneri.

Затем подготовьте сетки электронной микроскопии, как описано в существующей публикации JoVE, а также задокументировано в текстовом протоколе. После загрузки ЭМ-столика коллекцией мини-ячеек, встроенных в остеклованный лед, приступайте к сбору карт с малым увеличением для серии наклонов. При просмотре флуоресцентного экрана при малом увеличении, около 2300x, найдите квадраты сетки, которые приемлемы для изображения.

Это место должно содержать тонкий лед и объект интереса без загрязнений. Затем настройте вид на центр квадрата сетки и нажмите на кнопку «Добавить положение рабочей области», чтобы сохранить местоположение. Затем повторяйте процесс до тех пор, пока все допустимые квадраты сетки не сохранят свое местоположение.

Следующий шаг начинается с открытия нового файла монтажа. В диалоговом окне настройки установите значения X и Y так, чтобы был захвачен весь квадрат сетки. Для стандартной сетки размером 200 меш создайте пространство 10 на 10 с высоким значением Binning, например, восемь.

Также включите опцию перемещения рабочей области вместо смещения изображения и опцию пропуска корреляций, используемых для выравнивания фигур. Теперь в окне «Навигатор» выберите первую позицию этапа, которую необходимо получить, с помощью переключателя «Получить». Продолжайте делать это для каждой позиции этапа.

Затем в меню «Навигатор» нажмите «Получить в точках». В открывшемся диалоговом окне переключите получение изображения карты и грубую евцентриситетность. Отключите все остальные параметры.

Затем нажмите «Продолжить», и для каждой позиции сцены будет сделан монтаж. Продолжайте работу с программным обеспечением SerialEM. В Навигаторе выберите полученные карты, и нажмите на кнопку Загрузить карту.

Затем нажмите «Добавить точки» и выберите точки на карте, где должен быть получен наклонный ряд. После выбора нажмите «Остановить добавление точек» и повторите процесс с каждой собранной картой. Далее откройте параметры в меню «Камера» и установите режимы «Фокус», «Проба» и «Запись».

Опция записи данных по дозированному фракционированию может представлять особый интерес, и ее можно указать в опциях Запись. Чтобы продолжить, выберите одну из точек на текущей карте и переключите опцию наклона в окне Навигатор. В открывшемся диалоговом окне выберите параметры для tilt-series.

Затем повторите процесс переключения опции tilt-series для каждой из выбранных точек на карте. Далее из Навигатора запускаем опцию Приобретать в точках. В диалоговом окне переключите следующие параметры: Предварительные задачи, Выровнять по элементу, Автофокус и Грубая эуцентричность.

Затем установите Основную задачу для получения tilt-series, и выберите Закрыть валы столбца в конце, чтобы закрыть столбец, когда все точки будут собраны. Когда процесс будет выполнен, в каждой точке будет собрана серия наклонов, которая будет переключаться на коллекцию серий наклонов на каждой карте. С помощью оригинальной серии наклонов, журнала вывода из SerialEM и отдельных изображений с дозированием в текущем рабочем каталоге терминала выполните следующую команду, чтобы удалить артефакт движения, вызванного лучом.

Приступайте к выравниванию и восстановлению ряда наклонов. Введите в терминале команду tomoauto следующим образом. К команде добавьте имя файла tilt-series to process, а затем реперный диаметр в нанометрах.

Если обработка CTF нежелательна, просто исключите эту опцию из команды. Эта команда является основным использованием tomoauto, позволяя пользователям выполнять все процессы, связанные с выравниванием наклонного ряда, которые первоначально требовали ручного вмешательства пользователя, в одной команде, что позволяет пользователям быстро создавать сценарии пакетной обработки. Теперь, используя команду 3dmod, просмотрите выровненный ряд наклонов на наличие явных ошибок.

Здесь filename - это название tilt-серии без суффикса. Затем проверьте предполагаемый CTF с помощью команды, показанной здесь. Опять же, filename - это название серии tilt без суффикса.

Кроме того, в журнале вывода, созданном командой tomoauto, проверьте остаточную ошибку выравнивания. Это количественная мера общего качества выравнивания. Если выравнивание приемлемо, то приступайте к расчету реконструкции.

Эта команда установлена для коррекции CTF и удаления реперных маркеров, используемых при выравнивании, из tilt-ряда. Чтобы пропустить визуальный осмотр, а перейти непосредственно к реконструкции, воспользуйтесь этой командой. У Tomoauto есть много доступных вариантов.

Одним из них, в частности, является возможность включения локальных конфигураций, описанных вспомогательным файлом, согласно документации tomoauto. Включите имя этого файла в диалоговое окно командной строки, используя параметр локальной конфигурации, прежде чем добавлять имя файла tilt-series. Возможность создания локальных конфигурационных файлов является самой мощной функцией tomoauto, позволяющей пользователям полностью настраивать каждую используемую команду, настраивая выполнение на конкретные или сложные наборы данных, сохраняя при этом автоматическую обработку.

В протокол тестирования включены дополнительные инструкции по выполнению усреднения субтомограммы. Следуя описанным протоколам, с помощью tomoauto были изготовлены две выровненные наклонные серии. Точное выравнивание вычисляется на основе модели, которая идеально определяет координаты реперного маркера.

50 градусов одна серия tilt-series правильно отслеживала золотые частицы, указывая на приемлемое выравнивание. В то время как в случае со второй серией наклона несколько точек модели, показанных красным цветом, отклонились от соответствующего золотого маркера, иллюстрирующие модель, не дали подходящего выравнивания. При сборе наклонных серий tomoauto успешно выравнивает от 80 до 90% собранных наклонных серий.

После реконструкции финальная томограмма представляет собой 3D объем образца изображения. Затем это может быть использовано для клеточной аннотации путем сегментации или усреднения субтомограммы для получения информации о молекулярном механизме с более высоким разрешением в образце. Среднее значение субтомограммы в 2,7 нанометра для прикрепленной Shigella flexneri, нанесенной в EMDB, показывает значительное улучшение этого метода по сравнению с просмотром инъекции на одной томограмме.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как собирать и обрабатывать данные криоэлектронной томографии с помощью SerialEM и tomoauto автоматизированным и высокопроизводительным способом. После освоения этой техники можно собрать почти 100 тилт-серий за день, если она выполнена правильно, и выровнять тилт-серию за 20 минут. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что всегда нужно проверять качество выравнивания серии наклонов.

Если набор наклонных серий не выравнивается, попробуйте выполнить выравнивание вручную и перенесите параметры в локальную конфигурацию. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как усреднение субтомограммы, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как определение структуры макромолекулярных комплексов с более высоким разрешением. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области крио-ЭМ для изучения структур in situ с высоким разрешением у бактерий, вирусов и других организмов.