Биолюминесценция основе метода Опухоль Количественное для мониторинга опухолевой прогрессии и эффектов лечения в лимфомы мыши Модели

Общая цель данной процедуры визуализации заключается в стандартизации процессов сбора данных биолюминесценции и анализа изображений для получения количественных данных, пригодных для сравнения внутри одного или между различными экспериментами. Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы в области биолюминесцентной визуализации, например: каким образом можно количественно оценить данные визуализации воспроизводимым способом? Основными преимуществами данной методики являются простота внедрения в любом виварии, оснащенном биолюминесцентным имиджером, и отсутствие необходимости в сложных вычислениях.

Включите имиджер и откройте программное обеспечение для сбора данных (Acquisition software). Нажмите Initialize, чтобы инициализировать камеру, предметные столики и объективы. Убедившись в достижении соответствующего уровня седации по отсутствию реакции на щипок за лапку, поместите мышь на греющую подложку и нанесите глазную мазь.

Затем с помощью иглы 25-го калибра внутрибрюшинно введите 100 µL свежеприготовленного раствора калиевой соли D-люциферина. В данном случае опухолевые клетки экспрессируют люциферазу светлячка. Этот белок окисляет D-люциферин, в результате чего возникает свечение, которое может быть зафиксировано с помощью системы визуализации.

Через 10 минут поместите мышь в имэджер в положении на животе так, чтобы спина была обращена к камере и располагалась максимально горизонтально. Выберите функцию автоматической экспозиции и нажмите Acquire, чтобы получить изображение животного в задней проекции. Затем переверните мышь на спину, раздвинув передние конечности, чтобы они не перекрывали область грудной клетки.

Убедитесь, что флажок автоэкспозиции по-прежнему выбран, и получите переднее изображение животного. Затем поместите мышь обратно на нагревательную подложку до полного восстановления, после чего животное можно будет вернуть в клетку. Для количественного определения биолюминесценции нажмите «View» в меню и выберите «Tool Palette», если она еще не отображается.

Затем нажмите на вкладку инструмента выделения области интереса, выберите кнопку контура и установите параметр Free Draw. С помощью инструмента Free Draw обведите края всего тела мыши или определенной области на изображении вида спереди, чтобы отметить область интереса, щелкнув правой кнопкой мыши для замыкания контура. Если в раскрывающемся меню единиц измерения в верхнем левом углу изображения еще не выбрано значение Radiance, выберите его.

После этого снимите показания в поле «Total Flux photons per second» для измерения потока фотонов. Затем откройте меню «View» и выберите «region of interest measurements». Повторив анализ для изображения в виде сзади, суммируйте значения потока фотонов, полученные для обоих ракурсов, чтобы рассчитать luminoscore.

В данном эксперименте опухоль можно было обнаружить уже через 10 минут после инъекции. Одних только изображений достаточно, чтобы подтвердить наличие опухолевых клеток в нужном месте. Однако количественное определение биолюминесценции выявило явную разницу между животными, получившими инъекции, и контрольной группой.

Примечательно, что сигнал, полученный в подкожной модели, был в 100 раз выше, чем в модели первичной интраокулярной лимфомы, что соответствует количеству введенных клеток. Здесь репрезентативные изображения роста опухоли у мышей с первичной интраокулярной лимфомой в контрольной группе и группе, получавшей CpG, демонстрируют, что по прошествии достаточного периода времени в контрольной группе начинают появляться метастазы. Хотя первичная опухоль не проявила чувствительности к терапии, в группе, получавшей CpG, наблюдалось меньше метастазов.

Действительно, количественный анализ опухолевой нагрузки в каждой группе показывает, что CpG замедляет развитие опухоли, создавая статистически значимую разницу в люминесценции опухоли между treated- и control-группами через 28 дней. В данной подкожной модели на каждую сторону мыши пересаживали по две опухоли, при этом лечение вводили in situ на одну сторону в нулевой день, а контралатеральная опухоль служила контролем. Затем для каждой мыши определяли две области интереса и измеряли соотношение показателей люминесценции (luminoscore) на обработанной и контрольной сторонах.

Через 13 дней после введения препарата наблюдалось значительное снижение коэффициента luminoscore, что свидетельствует о резорбции treated tumor, что дополнительно подтверждается соответствующими изображениями биолюминесценции. При правильном выполнении данный анализ занимает две минуты на одно животное. После этой процедуры можно применить другие методы, такие как качественное определение локализации опухоли, чтобы ответить на дополнительные вопросы о механизмах хоминга или метастазирования опухолевых клеток.

После своей разработки этот метод открыл исследователям и области биолюминесцентной визуализации путь к изучению прогрессирования опухоли на доклинических моделях мелких животных. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить биолюминесцентную визуализацию для количественной оценки опухолевой нагрузки воспроизводимым способом. Не забывайте, что работа с мелкими животными и хирургическими инструментами может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как надлежащая стерилизация инструментов.