Выделение и характеристика Mouse антрального ооцитов на основе организации хроматина ядрышка

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы подробно описать все этапы, необходимые для определения характеристик антральных ооцитов мышей на основе их хроматиновой организации в соответствии с их способностью полностью поддерживать перспективное эмбриональное развитие. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, например, как различить и изолировать два различных вида антральных ядрышек: SN, окруженное ядрышко, и NSN, неокруженное ядрышко, обитающее в антральном компартменте яичника млекопитающих. Чтобы собрать яичники, начните с введения 3-6-недельным самкам мышей IP 2,5 международных единиц гонадотропина сыворотки беременной кобылы.

Через два дня, примерно за час до сбора урожая, наполните одну стерильную чашку Петри средой М2 и добавьте несколько капель среды М2 по 20 микролитров во вторую чашку Петри, покрывая каждую каплю 1,5 миллилитрами минерального масла. Затем перенесите все чашки Петри в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом, чтобы среда сбалансировалась. Затем с помощью стерильных ножниц для рассечения сделайте разрез на коже, покрывающей брюшную стенку, с последующим разрезом в брюшине первой мыши, которой ввели гормоны.

С помощью стерильного пинцета отодвиньте кишечник в сторону, чтобы локализовать маточные трубки, которые образуют V-образную форму, начиная от мочевого пузыря. После расположения яичников ниже почек возьмитесь за одну маточную трубу и освободите соответствующий яичник с небольшим разрезом в нижней части ткани. Повторите процесс, чтобы собрать другую завязь, а затем поместите обе завязи в чашку Петри, заполненную предварительно уравновешенной средой М2.

Перед выделением антрального ооцита сделайте пипетки со стеклянным ртом, взявшись за оба конца стеклянной пипетки Пастера и держа пипетку горизонтально над пламенем горелки Бунзена. Когда стекло начнет плавиться, снимите пипетку с пламени и быстро раздвиньте инструмент. С помощью ногтя плотно отрежьте лишнее стекло близко к узкому концу пипетки, чтобы укоротить кончик и добиться внутреннего диаметра капилляра около 100 микрон.

Важно иметь правильный диаметр пипетки. Если она слишком узкая, ойкты застревают, фрагментируются и погибают. Затем подсоедините неизмененный конец пипетки к аспираторной трубке.

Далее переложите яичники в чашку Петри, содержащую один миллилитр предварительно уравновешенной М2 среды, и с помощью стерильной иглы инсулинового шприца аккуратно проколите антральные фолликулы яичников. По мере высвобождения ооцитов аккуратно соберите их с помощью пипетки для рта, стараясь не допустить аспирации клеток фолликулов или других остатков тканей. Затем быстро пипетируйте каждый ооцит через несколько капель предварительно уравновешенной среды M2, чтобы удалить все кучевые клетки, прикрепленные к zona pellucida ооцитов.

После того, как ооциты были оголены, осторожно расположите ооциты на дне отдельных капель свежей уравновешенной среды М2. Чтобы окрашивать ооциты, с помощью ротовой пипетки переведите клетки в капли по 20 микролитров Hoechst 33342, разведенные в среде М2. Затем перенесите ооциты в новую чашку Петри, содержащую пять микролитров капель М2 среды, покрытой минеральным маслом, заботясь о том, чтобы ооциты располагались по отдельности на дне каждой капли.

Когда все ооциты будут перенесены, поместите чашку под флуоресцентный микроскоп и возбуждайте клетки ровно настолько, чтобы визуализировать наличие или отсутствие кольца вокруг ядрышка. Следите за тем, чтобы не переэкспонировать яйцеклетки, так как хроматин может быть поврежден, и ооциты могут погибнуть, если они будут подвергаться слишком длительному воздействию. После того, как ооциты SN и NSN были идентифицированы, отсортируйте клетки в соответствующую чашку Петри в соответствующем реагенте для желаемого последующего анализа в соответствии с их хроматиновой организацией.

Окрашивание Hoechst 33342 для организации хроматина, вероятно, является наиболее важным этапом процедуры. От 5 до 10 секунд возбуждения должно быть достаточно, чтобы отсортировать ооциты на основе наличия или отсутствия хроматина, окружающего ядрышко каждого ооцита. После освоения этой техники она может быть выполнена менее чем за три часа при правильном выполнении.

При попытке провести эту процедуру важно работать при комнатной температуре и помнить о бережном обращении с яичниками и ооцитами. После этой процедуры ооциты могут быть использованы для созревания in vitro и экстракорпорального оплодотворения. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии развития, чтобы ответить на все еще открытый вопрос: как распознавать и различать два вида антральных ооцитов, обитающих в яичниках млекопитающих.

После просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как делать и использовать собственную ротовую пипетку, как выделять и сортировать антральные ооциты с помощью окрашивания Hoechst 33342. Не забывайте, что работа с животными и клетками требует особых мер предосторожности, таких как ношение средств индивидуальной защиты и использование стерилизованных инструментов.