Фаг-опосредованной доставки целевых рРНК Создаёт к нокдауна экспрессии генов в E. палочки

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы сбить гены, представляющие интерес в растущей популяции кишечной палочки. Нокдауны генов часто используются для изучения основных вопросов функции генов. Эти методы также могут быть применены в синтетической биологии.

Например, в подавлении нежелательных генов, таких как факторы вирулентности. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть выполнена в групповых культурах E.coli без предварительной генетической модификации, а результаты можно наблюдать уже через несколько часов. Для начала, используя плазмиду, содержащую кассету экспрессии sРНК, разработанную в соответствии с текстовым протоколом, проведите сайт-направленный мутагенез на последовательности, предварительно идентифицировав 24-парную направляющую последовательность в кассете экспрессии.

Проектирование и синтез прямых и обратных праймеров с короткими областями гомологии к существующей кассете мРНК, фланкирующими новую последовательность из 24 пар оснований. Приготовьте пятимиллилитровую культуру E.coli в LB и антибиотики, несущие матрицу фагемида экспрессии мРНК. Выращивайте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием.

После извлечения и очистки матричной сРНК-фагемида из культуры готовят две ПЦР-реакции, используя от 10 до 50 раз больше рекомендуемого количества ДНК-матрицы для фагемида сРНК и высокоточной полимеразы. Приготовьте одну реакцию с прямым и одну с обратным праймером. После использования стандартных условий ПЦР для запуска реакций объедините две реакции в микроцентрифужной пробирке.

Затем отжигите изделия путем нагревания до 98 градусов Цельсия на кипящей водяной бане. Немедленно выключите источник тепла и дайте ванне медленно вернуться к комнатной температуре в течение следующего одного-двух часов. Чтобы устранить немутировавшую матричную sРНК, добавьте в смесь один микролитр фермента рестрикции DpnI, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, или в течение времени, рекомендованного производителем для полного переваривания.

Затем преобразуйте химически компетентные клетки E.coli с помощью от одного до пяти микролитров отожженного продукта ПЦР. Затем изолируют отдельные колонии путем селективного осаждения на LB-планшеты антибиотиками. Проверить включение правильной последовательности направляющих с помощью ПЦР колонии.

Используйте наконечник для пипетки объемом 200 микролитров, чтобы собрать небольшое количество клеток из одной трансформированной колонии. Добавьте собранные клетки в 50 микролитров воды без нуклеаз в микроцентрифужную пробирку и перемешайте с помощью пипетирования. Затем с помощью настольного амплификатора или кипящей водяной бани лизируйте клетки, нагревая до 95 градусов Цельсия в течение двух минут.

Используя один микролитр лизированных клеток в качестве матрицы ДНК, проведите ПЦР в соответствии с показанными здесь условиями. После проверки правильности направляющей последовательности инокулируйте пятимиллилитровую культуру правильным клоном мРНК и выращивайте клетки в течение ночи. На следующий день приготовьте глицериновый бульон, смешав 750 микролитров ночной культуры с 250 микролитрами 60% глицерина в криопробирке с завинчивающейся крышкой.

Для приготовления фагемидовых подвоев, упакованных в M13, приготовьте в течение ночи пятимиллилитровую культуру E.coli, несущую фагемид экспрессии мРНК. Кроме того, приготовьте на ночь пятимиллилитровую культуру E.coli, несущую вспомогательную плазмиду M13KO7. На следующий день, после очистки ДНК, химически компетентную кишечную палочку совместно преобразуют с одним микролитром фагемида экспрессии мРНК и хелперной плазмиды.

Пластину на LB-агар с антибиотиками подбирать для обоих конструктов. Экспрессия фагемидов является большой нагрузкой на клетки и может привести к снижению эффективности трансформации. Может потребоваться введение плазмиды в два этапа последовательного превращения.

После инкубации трансформированных клеток в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия приготовьте культуру объемом 10 миллилитров из одной колонии котрансформированного штамма. На следующее утро центрифугируйте культуру при 3300 x g в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость и профильтруйте через фильтр 0,2 мкм.

Храните упакованный фагемидный фильтрат при температуре четыре градуса Цельсия. После подготовки клеток F+мишени, согласно текстовому протоколу, инокулируйте одну колонию в пятимиллилитровую культуру среды LB антибиотиками и выращивайте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. На следующий день используйте пять миллилитров селективной среды LB, чтобы разбавить F+клетки-мишени от одного до ста, и продолжайте инкубацию.

Культивируйте клетки в течение примерно двух часов до тех пор, пока не будет получен OD600 0,3, указывающий на рост в логарифмической фазе. Клетки, подлежащие сайленсингу, должны находиться в экспоненциальной фазе при экспрессии молчания F pilus для эффективной фагемидной инфекции. Добавьте соотношение фагемидов, упакованных в M13, к клеткам-мишеням, чтобы достичь почти 99% инфицирования целевой популяции.

Дайте инфекции протекать при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием в течение 30-60 минут. Затем по желанию проанализируйте фенотип, подавляющий подавление мРНК. Следуя протоколу, показанному в этом видео, кассета для сайленсинга sRNA плазмиды pAB.

001 был изменен на цель на mKate2. Этот рисунок показывает, что штамм E.coli, инфицированный фагемидом анти-mKate2, не показал обнаруживаемой флуоресценции mKate2 на фоне. Тем не менее, этот штамм экспрессировал GFP, что указывает на успешное поглощение фагамида.

В этом эксперименте штамм E.coli с хромосомно интегрированной хлорамфениколацетилтрансферазой, или геном CAT, был инфицирован фагемидом, нацеленным на CAT, и было протестировано подавление резистентности к хлорамфениколу на основе мРНК. Клетки, в которых фагемид был нацелен на CAT, показали снижение выживаемости при низких концентрациях хлорамфеникола и почти 99% убийств при более высоких концентрациях. С другой стороны, неинфицированные клетки или клетки, инфицированные мРНК, которые подавляют mKate2, были устойчивы к хлорамфениколу во всех протестированных концентрациях.

Как показано здесь, добавление ампициллина, используемого для отбора только бактерий, несущих фагемид, снижает выживаемость хлорамфеникола до неопределяемого уровня. Изменение гена-мишени sRNA и производство инфицированного фагемида может быть выполнено за пять дней. Не забывайте, что работа с фагами может быть чрезвычайно опасной для других экспериментов в лаборатории, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование специального лабораторного оборудования, чтобы избежать нежелательного загрязнения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как конструировать, клонировать и производить инфицированные фагемиды, несущие sRNA, чтобы сбить любой ген, представляющий интерес в активно растущей популяции E.coli.