DamID-след: Генома Отображение белок-ДНК взаимодействий с высокой пропускной секвенирования аденина-метилированных фрагментов ДНК

Общая цель этого протокола заключается в обнаружении последовательностей геномной ДНК, связанных с белками, представляющими интерес в клетках животных, с помощью высокопроизводительного секвенирования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в изучении ядерной организации и транскрипции или регуляции в клетках млекопитающих, такие как идентификация областей генома, связанных с ядерным амилоидом или со специфическими факторами транскрипции. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что высокопроизводительное секвенирование обеспечивает более высокое разрешение, чем исходный актив DamID, с использованием микрочипов ДНК, и что этот метод позволяет проводить перекрестный анализ с нашими данными секвенирования с высокой пропускной способностью.

Демонстрировать процедуру будет Бреннан Олсон, техник из нашей лаборатории. Для начала следуйте текстовому протоколу, чтобы клонировать интересующий ген в вектор DamID. Затем сгенерируйте лентивирусные акции, экспрессирующие DamV5 POY и V5-Dam, используя систему экспрессии лентивирусов.

Котрансфектировать вектор DamID с плазмидами лентивирусной упаковки после процедуры прямой трансфекции в соответствии с протоколом производителя. Обязательно включите этап фильтрации с использованием фильтра из PVDF с нулевыми целыми четыре десятых пять микрон. Теперь приготовьтесь к заражению клеток лентивирусом.

За сутки до этого пропустите адгезивные клетки на шестилуночных планшетах. Продолжайте принимать антибиотики. Цель состоит в том, чтобы на следующий день было 50% слияние инфекции.

На следующий день достаньте замороженные надосадочные жидкости DamV5 POY и V5-Dam лентивирусные надосадочные жидкости из морозильной камеры и поместите их на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия для оттаивания. С тарелок для культивирования удалите питательную среду и замените ее половиной миллилитра свежей питательной среды без антибиотиков. Затем загрузите в лунки миллилитр размороженного лентивируса.

Загрузите две скважины V5-Dam, две скважины DamV5 POY и две скважины без лентивируса в качестве отрицательного контроля. Разлейте раствор по ячейкам и верните планшет в инкубатор. Через 24 часа замените вирусные суспензии на клетках двумя миллилитрами питательной среды без антибиотиков.

Затем продолжайте инкубацию еще в течение 48 часов. Через два дня завершите этот процесс, следуя текстовому протоколу для выделения геномной ДНК, что должно занять около часа. Затем амплифицируйте метилированные аденином фрагменты ДНК из геномной ДНК.

Этот процесс занимает около двух-трех дней, а детали освещаются в текстовом протоколе. Для этой процедуры сначала фрагментируют амплифицированную метилированную аденин-метилированную ДНК. Перед использованием фрагментазы ДНК важно сначала измерить ее силу, чтобы определить подходящее время переваривания.

Используйте любые доступные очищенные продукты для метиловой ПЦР для этого диагностического теста. Начните с создания мастер-смеси, состоящей из шести микрограммов ДНК, 12 микролитров 10-кратного буфера фрагментазы, и заполните ее водой до 114 микролитров. Затем перебейте бульон фрагментазы на три секунды и добавьте шесть микролитров в мастер-смесь, чтобы в общей сложности 120 микролитров.

Затем сделайте мастер-микс вихрем в течение трех секунд. Теперь заполните пять реакционных пробирок 20 микролитрами аликвоты мастер-смеси и инкубируйте все шесть пробирок при температуре 37 градусов Цельсия. Удалите одну пробирку через пять минут и добавьте пять микролитров ЭДТА, чтобы остановить реакцию.

Делайте это каждые 10 минут, пока не соберутся все реакционные пробирки. Теперь проанализируйте 12 целых пять микролитров из каждой пробирки, что соответствует примерно половине микрограмма ДНК, и столько же непереваренной ДНК на агорозном геле. По гелю определите минимальное время, необходимое для переваривания большей части мазка примерно до нуля целых двух целых килобаз.

Используйте это как максимальное время переваривания. Теперь настройте фактическую фрагментацию, как в предварительном тесте, и остановите переваривание в шести равномерно распределенных временных точках, включая пять минут, и рассчитайте максимальное время. После разложения вытащите шесть разложений и очистите их с помощью набора для очистки ПЦР или твердофазных обратимых иммобилизационных шариков.

Разведите очищенную ДНК примерно в 15 микролитрах буфера EB. Следующими шагами являются восстановление концов фрагментированной ДНК, добавление адениновых выступов, лигада на адаптерах секвенирования и преобразование Y-образных адаптеров в двухцепочечную ДНК. Все эти шаги подробно описаны в текстовом протоколе и не должны занимать более двух дней.

После лигирования адаптеров секвенирования к фрагментированной ДНК и преобразования Y-образных адаптеров в двухцепочечную ДНК выберите фрагменты нужного размера. Начните с приготовления двухпроцентного геля агороза в ТАЭ, и, соблюдая меры предосторожности, добавьте бромид этидия до конечной концентрации 500 нанограмм на миллилитр. Сделайте достаточное количество дорожек для всех образцов и две лестницы, которые были бы ограничены пустыми полосами.

Теперь добавьте восемь микролитров загрузочного красителя к 10 микролитрам каждого элюата ДНК и приготовьте лестницу 1 Kb Plus с 6X загрузочным красителем и водой в соотношении один к одному к четырем. Затем загрузите гелевые дорожки в следующем порядке: лестница ДНК, лестница ДНК и еще одна лестница ДНК. После загрузки запускайте гель при напряжении 120 вольт каждые 60 минут.

Позже наденьте защитные очки и защитный щиток для лица, чтобы кратко рассмотреть гель в ультрафиолетовом свете. Проверьте лестницы ДНК, чтобы увидеть, не ушел ли гель достаточно далеко, чтобы можно было вырезать три среза геля от 300 до 400 пар оснований. Затем вырежьте полосы между 300 и 400 парами оснований с каждой дорожки, всегда используя новое лезвие для каждой дорожки.

Удалите как можно меньше геля, чтобы каждый срез геля идеально не превышал 100 микролитров, и перенесите каждый в отдельную пробирку с микрофугами. Далее извлеките ДНК из срезов геля согласно текстовому протоколу. Продолжайте следовать текстовому протоколу о том, как обогатить адаптер секвенирования модифицированными фрагментами из извлеченной ДНК.

Затем получить качественный анализ очищенной ДНК с помощью биоанализатора, и если он соответствует ожиданиям, отправить его на секвенирование. Лентивирусы были сконструированы для экспрессии гибридного белка Dam-V5-ламина B1, который, как было подтверждено, колокализован с эндогенным белком ламина B1 путем аминофлуоресцентного окрашивания. Этот лентивирус и контрольный лентивирус, экспрессирующий гибридный белок Dam-V5, были использованы для инфицирования мышиных миобластов C2C12.

ДНК собирали и амплифицировали для метилированных фрагментов аденина, как описано, а затем секвенировали. Затем были построены карты взаимодействия NL генома для хромосомы. На одной дорожке показано соотношение log2 об/км.

На другой дорожке черным цветом показаны домены, связанные с пластинками. Это районы, которые значительно больше связаны с плотиной В1, чем с контрольной плотиной. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение двух недель, если она выполнена правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как обнаруживать последовательности ДНК, связанные с интересующими вас белками, с помощью высокопроизводительного секвенирования в сочетании с DamID. Не забывайте, что работа с бромидом этидия и ультрафиолетовыми лучами может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ожидание остывания геля перед добавлением бромида этидия, а также ношение защиты глаз и лицевого щитка.