Первичный энтодермальная эпителиальной клетки культуры из желтка мембраны японского перепела Эмбрионы

Общая цель данной процедуры получения эксплантатов ex vivo заключается в совершенствовании сбора и расширении применения энтодермальных эпителиальных клеток птиц для изучения функции ферментов и белков в опосредовании утилизации питательных веществ эмбрионами птиц. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся утилизации липидов в ходе эмбриогенеза птиц, например, о том, как липиды желтка упаковываются и транспортируются из желтка к эмбриону на поздних стадиях развития. Основным преимуществом данной методики является возможность успешного выделения функциональных энтодермальных эпителиальных клеток из желточной мембраны японского перепела, которые могут быть использованы в качестве модели для изучения эмбрионального развития птиц.

Начните с приготовления 10-кратного раствора PBS, как описано в текстовом протоколе. Разведите этот стоковый раствор в соотношении 1:10 для получения 1-кратного PBS, который будет использоваться для промывания мембраны желточного мешка при выделении эндодермы. Для приготовления ростовой среды для эндодермальных эпителиальных клеток (EEC) сначала дополните DMEM/F-12 10% сывороткой новорожденного теленка и 1% раствором пенициллина, стрептомицина и амфотерицина.

После этого погрузите электрод pH-метра в предварительно приготовленную среду DMEM. Покапельно добавляйте в среду 3N HCl до достижения значения pH 7,2. Собрав примерно два десятка оплодотворенных яиц перепела, поместите их вертикально в контейнеры для яиц так, чтобы их широкие, не заостренные концы, где расположены воздушные камеры, были направлены вверх.

Затем перенесите яйца в хорошо вентилируемый инкубатор, установленный на 37 °C. После пяти дней инкубации осмотрите яйца с помощью овоскопа. Если эмбрионы развиваются нормально, под воздушной камерой должна быть видна кольцевая структура капиллярных сосудов.

Выберите яйцо с нормальным развитием капилляров и очистите скорлупу свежей водой и 75% этанолом. Затем с помощью ножниц вскройте скорлупу в области воздушной камеры. Используя пинцет, осторожно помогите вылить содержимое яйца в пустую чашку Петри диаметром 10 cm.

Затем с помощью ножниц отделите эмбрион, желток и любой альбумин от мембраны желточного мешка (сокращенно YSM). После выделения промойте YSM трижды в 1x PBS, а затем перенесите её в новую чашку диаметром 10 см с PBS. После этого поместите чашку под dissecting scope.

Затем с помощью ножниц удалите остатки яичного белка, прилегающие к внешнему эктодермальному слою YSM. Далее с помощью пинцета приподнимите полупрозрачную эктодерму и красную капиллярную структурную мезодерму от края мезодермы на мембране желточного мешка. После этого осторожно отделите эктодерму и мезодерму вместе, чтобы изолировать нижележащий слой клеток энтодермы.

Затем одним пинцетом крепко зажмите желтый слой энтодермы мембраны. Другим пинцетом захватите капиллярную мезодерму и аккуратно отделите мезодерму от границы ее соединения с энтодермой. С помощью ножниц отсеките оставшийся слой желтой энтодермы и перенесите его в чашку для культивирования диаметром шесть сантиметров, наполненную питательной средой.

С помощью пипетки перенесите светло-желтый энтодерм из чашки для культивирования диаметром шесть сантиметров в центрифужную пробирку объемом 15 mL после сбора YSM, и добавьте в нее 15 mL предварительно приготовленной ростовой среды. Поместите коническую пробирку в водяную баню при температуре 37 °C до завершения сбора всех образцов тканей. Начните с растворения 6,5 единиц коллагеназы IV типа в 10 mL DMEM.

Затем центрифугируйте пробирки с эндодермой при 130 g в течение трех минут при комнатной температуре. После центрифугирования аспирируйте среду и с помощью пипетки-дозатора перенесите все образцы эндодермы в чашку для культивирования диаметром шесть сантиметров. Затем добавьте в чашку один миллилитр раствора коллагена.

С помощью изогнутых ножниц нарежьте энтодерму, собранную из четырех эмбрионов перепела, на фрагменты размером примерно два-три миллиметра. Затем поместите фрагменты в центрифужную пробирку объемом 50 mL, в которой уже находится девять миллилитров свежего раствора коллагеназы. Для улучшения пролиферации клеток на стадии эксплантации поместите пробирку в шейкер-термостат с водяной баней, установленной на 37 °C.

Затем инкубируйте коническую пробирку в течение 30 минут для частичного переваривания ткани коллагеназой. Частичный протеолитический гидролиз является наиболее важным этапом для повышения выхода клеток при сборе эндодермы желточной мембраны желточного мешка. Наши данные показывают значительное повышение эффективности культивирования и пролиферации клеток при использовании процедуры обработки коллагеназой.

После переваривания коллагеназой центрифугируйте ткань при 130 ×g в течение трех минут при комнатной температуре, затем удалите супернатант с помощью пипетки. Промойте осадок, ресуспендировав его в 20 mL DMEM. Центрифугируйте пробирку, как описано выше, после чего удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 12 mL ростовой среды.

Затем осторожно добавьте по 500 µL суспензии в каждую лунку 24-луночного планшета. Инкубируйте эксплантаты энтодермы в течение двух дней при 37 °C в среде с 5% CO2. В течение этого времени ожидается пролиферация клеток из тканей.

Затем инкубируйте клетки еще в течение двух дней. После этого проведите анализ жизнеспособности клеток и визуализируйте результаты с помощью планшетного ридера. В завершение выполните RT-qPCR для оценки уровней экспрессии интересующих маркеров в EECs и проверьте размер продукта RT-qPCR с помощью гель-электрофореза, как описано в текстовом протоколе.

По сравнению с необработанными эксплантами, образцы, подвергнутые частичному перевариванию коллагеназой, продемонстрировали значительно более высокую пролиферацию клеток, что показано на данных графиках и подтверждено парным t-критерием, что свидетельствует об эффективности системы культивирования. Для оценки воздействия других ферментов были проведены анализы жизнеспособности клеток в тканях, обработанных коллагеназой и диспазой, либо только коллагеназой. В течение первых пяти дней инкубации рост клеток в обоих случаях был схожим.

Однако с шестого по девятый день устойчиво пролиферировали только EEC, обработанные коллагеназой, что свидетельствует о том, что частичное переваривание этим ферментом улучшает рост и должно использоваться преимущественно. При визуализации культивируемые EEC демонстрировали признаки, характерные для адипоцитов, в виде крупных округлых липидных капель, как показано здесь. Такие клетки также давали положительный результат при окрашивании Oil Red O, которое обычно используется для идентификации адипоцитов.

В подтверждение этих морфологических данных количественная ПЦР в реальном времени показала, что культивируемые EEC демонстрируют высокий уровень экспрессии SOAT1 — белка, синтезирующего эфиры холестерина из холестерина. Это дополнительно свидетельствует о том, что культивируемые EEC обладают соответствующими физиологическими характеристиками адипоцитов. Важно отметить, что при воздействии на EEC IBMX и форсколина — факторов, повышающих уровень циклического аденозинмонофосфата (cAMP), — и последующем культивировании в течение 24 часов оба воздействия стимулировали экспрессию SOAT1, что указывает на возможные механизмы регуляции SOAT1 и утилизации липидов в YSM.

После освоения данная методика занимает около четырех часов, за которые можно собрать как минимум три образца. После выполнения этой процедуры можно провести такие методы, как анализ SOAT1 или другие тесты на ферментативную активность, а также аналогичное визуальное подтверждение. Такие анализы могут помочь ответить на дополнительные вопросы, например, о том, как определенные белки и макронутриенты участвуют в более поздних стадиях эмбрионального развития.

После разработки этот метод открыл исследователям в области использования питательных веществ эмбрионом возможность изучить возможный механизм, посредством которого питательные вещества используются и транспортируются в модельной системе эмбриона птицы. После просмотра этого видео вы научитесь собирать ткани энтодермы эмбрионов птиц, а также узнаете, как культивировать EEC для изучения транспорта и использования питательных веществ эмбрионом с использованием модели птицы.