Идентификация Kinesin-1 Грузы с помощью флуоресцентной микроскопии

Общая цель данной методики заключается в идентификации грузов кинезина-1 с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод помогает нам ответить на ключевые вопросы в области молекулярных моторов, например, какие грузы перевозятся кинезинами и миозинами. Основное преимущество этой методики заключается в том, что доминирующие отрицательные мутанты KIF5B могут помочь нам визуально идентифицировать этот груз с помощью флуоресцентной микроскопии.

Для начала для получения визуализации живых клеток или непрямой флуоресценции с температурой 40X или ниже введите от 0,2 до 0,3 миллиона клеток HeLa в одном миллилитре полной среды в каждую лунку шестилуночного планшета. Выращивайте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с пятью процентами углекислого газа. Для непрямых иммунофлуоресцентных исследований с увеличением выше 40X, в шкафу биобезопасности, чтобы избежать загрязнения, используйте абсолютный спирт для мытья защитных стекол и поставьте их в лунки шестилуночного планшета для сушки на воздухе.

Когда покровные листы высохнут, уложите их в лунки и засейте от 0,2 до 0,3 миллиона клеток в одном миллилитре полного DMEM в каждую лунку пластины. Культивируйте клетки на ночь. На следующий день в шкафу биобезопасности используйте 0,1 миллилитра трансфекционной среды, чтобы разбавить 0,6 микрограмма плазмиды дикого типа или безмоторной экспрессии KIF5B с плазмидой или без нее, экспрессирующей потенциальный карго-белок.

В еще одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,6 мл добавьте 1,8 микролитра реагента для трансфекции на 0,1 миллилитра среды для трансфекции. Затем выдерживают при комнатной температуре в течение пяти минут. Далее добавьте 0,1 миллилитра разведенного реагента для трансфекции в разведенные образцы ДНК.

Переверните трубки, чтобы перемешать содержимое, и убавьте в течение пяти секунд. Затем инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 45 минут. В период инкубации для формирования трансфекционного комплекса используйте PBS для промывания клеток три раза.

Затем в каждую лунку добавьте по 0,8 миллилитра предварительно подогретой трансфекционной среды, и верните пластины в инкубатор. После того как разведенный реагент для трансфекции выдержит 45 минут, добавьте по 0,2 миллилитра раствора по каплям в каждую лунку планшета. Осторожно покачивайте шестилуночную пластину в течение пяти секунд и верните ее в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на шесть-восемь часов.

Затем используйте полный DMEM для замены носителя. Для проведения визуализации живых клеток после дополнительных 16 часов инкубации добавьте интеркалирующий краситель ДНК Hoechst 33342 в среду до конечной концентрации 1 микромоль и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем, используя объектив 40X, исследуйте клетки на экспрессию флуоресцентных белков.

Для проведения непрямой иммунофлюоресценции на клетках, которые были инкубированы с реагентом для трансфекции: После приготовления параформальдегида в соответствии с текстовым протоколом используйте PBS комнатной температуры для промывания клеток, вращая шестилуночную пластину в течение пяти секунд. Добавьте один миллилитр свежеприготовленного 4%-ного параформальдегида и PBS на лунку и выдерживайте при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем используйте PBS, чтобы промыть клетки один раз, вращая пластину, и выбросьте раствор.

Затем добавьте по одному миллилеру 0,1% Triton-X 100 в PBS в каждую лунку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы проникнуть в клетки. Затем используйте PBS для промывания клеток четыре раза, выбрасывая раствор после каждой промывки. Добавьте первичные антитела и инкубируйте клетки при комнатной температуре с укачиванием в течение четырех часов.

После инкубации используйте PBS для четырехкратной промывки клеток, вращая планшет. Затем добавьте один миллилитр флуоресцентного красителя, конъюгированные вторичные антитела и выдержите в темноте при комнатной температуре с укачиванием в течение двух часов. После четырехкратного промывания клеток PBS добавьте один миллилитр DAPI и выдержите в темноте при комнатной температуре в течение десяти минут.

Если вы используете покровные стекла с образцами, нанесите 10 микролитров монтажного раствора в центр предметного стекла микроскопа и установите покровное стекло поверх монтажного раствора. Затем инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение ночи. На следующий день используйте лак для ногтей, чтобы запечатать края, и выдержите в темноте в вытяжном шкафу в течение ночи.

Для проведения флуоресцентной микроскопии используйте объектив 40X с наборами фильтров для DAPI, CFP, FITC и Cy3, где это применимо. Как показано на рисунке, экзогенно экспрессированный KIFB дикого типа появился в цитоплазме однородно, в то время как c-MYC появился преимущественно в ядре. Однако безмоторный мутант KIF5B образовывал агрегаты в цитоплазме, и это приводило к агрегации c-MYC.

Кроме того, безмоторный KIF5B также индуцировал агрегацию эндогенного c-MYC и транскрипционного фактора p53, что указывает на то, что c-MYC и p53 являются грузами кинезина-1, а KIF5B регулирует субклеточную локализацию обоих эндогенных белков. Этот рисунок показывает, что движение транскрипционных факторов KIF5B является специфичным, поскольку экспрессия безмоторного мутанта KIF5B не влияет на субклеточную локализацию c-Fos и не вызывает его агрегации. Эти данные свидетельствуют о том, что метод, продемонстрированный в этом видео, позволяет проводить высокоспецифичную идентификацию грузов кинезина-1.

При попытке проведения этой процедуры важно помнить, что кинезины наиболее подходят для клеток с большим объемом цитоплазмы, так что агрегацию в цитоплазме можно легко наблюдать. После этого развития этот метод проложил путь исследователям в области молекулярных моторов к созданию подобных доминантных негативных мутантов других кинезинов и миозинов с целью идентификации их специфических грузов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать доминантный негативный мутант молекулярного мотора для идентификации этого груза с помощью флуоресцентной микроскопии.

Не забывайте, что работа с фено, бромидом этидия и параформальдегидом может быть чрезвычайно опасной, и всегда следует соблюдать меры предосторожности, чтобы избежать прямого контакта с кожей во время выполнения этой процедуры. Спасибо за просмотр. Удачи в вашем эксперименте.