Выделение Лейкоциты проникают из кожи мыши, используя ферментативные дайджест и Gradient Разделение

Общая цель этой процедуры заключается в выделении инфильтрирующих кожу лейкоцитов с помощью ферментативного разложения и разделения градиента плотности. Этот метод может быть применен для исследования клеточных и молекулярных механизмов во многих мышиных моделях кожных патологий, включая атопический дерматит. Хотя этот метод может дать представление о биологии инфильтрирующих кожу лейкоцитов, он также может быть применен для исследования других популяций резидентных клеток.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности с забором кожи, который включает в себя полное удаление избытка жировой и соединительной тканей. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как забор кожи и работа с градиентом плотности сложны в освоении и требуют точности и практики. В подходящий момент времени после лечения с помощью 10-сантиметровых хирургических ножниц аккуратно иссеките участок 25 на 25 миллиметров выбритой кожи бока взрослой самки мыши ND4 Swiss-Webster в возрасте от 8 до 12 недель.

С помощью чистого острого хирургического лезвия соскребите излишки жира и соединительной ткани с кожи, затем переложите кожу в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую 10 миллилитров HBSS комнатной температуры, дополненной ЭДТА, HEPES и FBS, и предварительно переварите ткань на вращающейся пластине в течение 30 минут в сухой, не отравленной газом форме. Инкубатор 37 градусов по Цельсию. В конце инкубации энергично перебейте трубку в течение десяти секунд и отфильтруйте тканевую кашицу через сетчатое фильтр 70 микрон. Затем с помощью пары щипцов перенесите кусочки кожи бока из ситечка в новую 50-миллилитровую трубку, содержащую десять миллилитров свежей среды HBSS комнатной температуры, дополненной ЭДТА, HEPES и FBS, затем используйте 12,5-сантиметровые ножницы для хирургического препарирования, чтобы измельчить каждый кусок кожи бока так, чтобы средний кусок ткани был примерно 2,2 на 2,2 миллиметра в размере.

Когда все кусочки будут измельчены, верните трубку на вращающуюся пластину для еще 30-минутной инкубации. В конце инкубации энергично перебейте пробирку на вихрь в течение 10 секунд и отфильтруйте содержимое через сетчатое фильтр 70 микрон. Соберите оставшиеся кусочки кожи пашины в новую 50-миллилитровую пробирку, содержащую 10 миллилитров HBSS с добавлением 0,7 миллиграмма на миллилитр коллагеназы D, и верните пробирку во вращающуюся тарелку для еще одной 30-минутной инкубации.

После еще 10 секунд вортекса снова отфильтруйте содержимое пробирки, на этот раз отбросив мусор на ситечко, затем заполните пробирку до 50 миллилитров HBSS, EDTA, HEPES, FBS, раскрутите ячейки и сцедите надосадочную жидкость. Добавьте три миллилитра центрифугирующей среды комнатной температуры, 67-процентной плотности в PBS в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров и повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах центрифугирующей среды с градиентом плотности 44 процента при комнатной температуре в HBSS с феноловым красным. Установив пипетку на самую низкую скорость, поместите пипетку сбоку от пробирки и аккуратно нанесите слой клеток поверх среды для центрифугирования с градиентом плотности 67 процентов.

При работе с градиентами плотности следите за тем, чтобы избежать образования пузырей и свести к минимуму любые сбои в границе раздела градиента. Затем разделите клетки, используя пятимиллилитровую пипетку для сбора клеток на границе раздела в конце центрифугирования. Поскольку осторожное наслоение градиента и тщательное извлечение границы раздела градиентов являются критически важными этапами, целесообразно практиковать наслоение среды центрифугирования плотности и удаление границы раздела с суспензией мышиных спленоцитов, прежде чем пытаться провести процедуру с экспериментальными клетками, представляющими интерес.

Наконец, промойте собранные клетки в ледяном PBS с добавлением FBS в конической пробирке объемом 15 миллилитров и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью исключения трипанового синего. Поверхностная экспрессия CD4 и CD8-альфа не зависит от расщепления коллагеназы D, так как одинаковое количество CD4-положительных и CD8-альфа-положительных клеток обнаруживается с ферментативным расщеплением или без него. Кроме того, расщепление коллагеназы D не оказывает влияния на поверхностную плотность маркеров активации Т-клеток CD44 и CD62L на CD4-положительных Т-клетках.

После градиентного разделения около 250 жизнеспособных иммунных клеток на квадратный миллиметр боковой ткани выделяют из оксазолона или мышей, подвергшихся воздействию Ox, по сравнению с только четырьмя жизнеспособными иммунными клетками на квадратный миллиметр ткани у мышей с воздействием носительства, предварительно сенсибилизированных Ox.95 процентов одиночных клеток с низким передним и боковым рассеянием у мышей, подвергшихся воздействию Ox, и 71 процент этих клеток в контрольной группе, подвергшейся воздействию, являются живыми CD45-положительными клетками. эквивалентно примерно 67-кратному увеличению инфильтрирующей популяции CD45-положительных иммунных клеток в боковой коже после трех ежедневных провокаций Ox. Действительно, провокация Ox приводит к выраженной инфильтрации Т-клеток и нейтрофилов в боковую кожу, при этом 42% одиночных живых CD45-положительных клеток у животных, получавших Ox, очевидные Gr-1-положительные нейтрофилы и примерно 84% CD3-положительных Т-клеток, экспрессирующих CD8-альфа, или CD4, по сравнению с контрольными животными, получавшими этанол. После освоения этой техники она может быть выполнена примерно за три часа, если она выполнена правильно.

При выполнении этой процедуры важно помнить о осторожном обращении с градиентом плотности. Не забывайте всегда использовать среду для центрифугирования с градиентом плотности при комнатной температуре при выполнении этой процедуры. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как проточный цитометрический анализ, сортировка клеток, перенос клеток или культура клеток in vitro для оценки фенотипа и функции инфильтрирующих кожу лейкоцитов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать инфильтрирующие кожу лейкоциты с помощью ферментативного разложения и центрифугирования градиента плотности.