Улучшение 2D и 3D кожи In Vitro Модели Использование макромолекулярных Crowding

Общая цель этой процедуры заключается в усилении отложения внеклеточного матрикса и улучшении существующих 2D и 3D моделей кожи с использованием макромолекулярного скученности. Скученность улучшает генерацию клеточных матриц и зрелых органотипических культур в сжатые временные рамки. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии, поскольку он предлагает улучшенные способы создания внеклеточных матрик клеточного происхождения для биоинженерии кожи и других тканей.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что матрицы, полученные из клеток, и органотипические конструкции кожи могут быть сгенерированы в значительно сжатые временные рамки при применении макромолекулярного скученности к этим культурам. Методика интерференционно-отражательной микроскопии позволяет визуализировать общее отложение внеклеточного матрикса без необходимости окрашивания антителами. Применение этих методов будет простираться от исследований отложения внеклеточного матрикса клетками кожи до улучшения терапии ран, особенно с созданием лучших эквивалентов кожи и культуры тканей для трансплантации.

Для начала засейте 50 000 первичных фибробластов, первичных кератиноцитов или их сокультуру в одном миллилитре средней пролунки в лунки 24-луночного планшета. Дайте клеткам прилипнуть в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа на ночь. Затем выбросьте старую среду и замените ее одним миллилитром свежей среды, содержащей высокомолекулярные краудеры и 100-микромолярную аскорбиновую кислоту.

Инкубируйте культуры в течение шести дней, меняя среду каждые два дня. Проводят иммунофлюоресценцию и вестерн-блоттинг согласно текстовому протоколу. Чтобы получить и использовать матрицу, полученную из клеток, после культивирования клеток в течение шести дней с помощью молекулярных краудеров и аскорбиновой кислоты, как показано выше, децеллюляризируйте клеточные слои для получения матрицы, полученной из клетки, сначала используя 1X PBS для двукратной промывки клеточных слоев.

Отсадите PBS, а затем добавьте 250 микролитров 0,5%-ного дезоксихолата натрия и выдерживайте на льду в течение 10 минут. Аспирируйте лизат клеток, затем добавьте еще 250 микролитров 0,5% дезоксихолата натрия и повторите 10-минутную инкубацию и аспирацию еще два раза. Используйте дистиллированную воду для двукратной промывки матрицы, полученной из клеток.

Вдохните воду, а затем добавьте 1X PBS. Храните матрицу при температуре четыре градуса Цельсия до одной недели. Чтобы приготовить суспензию вторичных клеток, аспирируйте PBS из матрикса и засейте 50 000 кератиноцитов поверх F-мата, например.

Дайте клеткам прилипнуть на ночь. Чтобы провести интерференционно-отражательную микроскопию (RIM) на матрице, производной от клетки, выполните получение изображения с помощью конфокального микроскопа в соответствии с текстовым протоколом. Чтобы отлить коллагеновый гель с фибробластами, инкапсулированными во вкладыш для клеточной культуры, добавьте 10 миллилитров коллагена крысиного хвоста первого типа в холодный стакан.

Добавьте один миллилитр холодного DMEM и 0,5 миллилитра одного молярного гидроксида натрия, чтобы нейтрализовать кислый коллаген. Затем добавьте 0,5 миллилитра суспензии фибробластов. С помощью холодной пипетки равномерно разделите 12 миллилитров раствора на вставки для клеточных культур в шестилуночный культуральный планшет.

Инкубируйте гель при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа. Как только гель застынет, погрузите его в среду фибробластов или FM. Затем, после инкубации в течение 24 часов, аспирируйте FM. Используйте четыре миллилитра свежей среды, содержащей высокомолекулярные краудеры, чтобы заменить старый FM, добавив два миллилитра внутрь вкладыша для клеточной культуры и два миллилитра снаружи вкладыша для клеточной культуры. После 24-часовой инкубации используйте 0,125% трипсина для тризонизации кератиноцитов.

Осторожно постучите по стенкам колбы, чтобы выбить клетки, и добавьте сыворотку, содержащую среду, чтобы нейтрализовать трипсин. После подсчета клеток приготовьте суспензию кератиноцитов. Затем аспирируйте среду из вкладышей клеточной культуры и добавьте кератиноциты в верхнюю часть геля.

Выдерживайте гель в течение одного часа. После того, как кератиноциты прикрепятся к поверхности геля, используйте два миллилитра KSFM или бессывороточной среды CTN-57, чтобы погрузить клетку внутрь вкладыша для гелевой культуры, и добавьте два миллилитра FM на внешнюю сторону вкладыша для клеточной культуры. После 24-часовой инкубации выбросьте старую среду и замените ее свежей средой, содержащей высокомолекулярные краудеры.

После семи дней пребывания в погруженной культуре, чтобы поднять культуру до границы раздела воздух-жидкость, перенесите культуральную вставку в глубоколуночную пластину. Добавьте 10 миллилитров стратификационной среды на внешнюю сторону вкладыша для клеточной культуры, сохраняя внутреннюю часть вкладыша сухой. Наконец, инкубируйте культуры и меняйте среду каждые три дня в течение 14 дней.

Собираем и обрабатываем их согласно текстовому протоколу. Как показано здесь, макромолекулярная скученность позволила фибробластам откладывать больше внеклеточного матрикса или ВКМ по сравнению с контрольными культурами. При секуляризации стало очевидно, что фибробласты являются основными отложениями коллагена один, коллагена 4 и фибронектина.

Этот рисунок демонстрирует, что именно фибробласты, а не кератиноциты, были основными депозиторами коллагена 7, и это первое сообщение об успешном отложении коллагена 7 in vitro. С помощью RIM был захвачен полный объем матрицы, полученной из клеток. Наложение изображения RIM с окрашиванием антителами показывает относительное количество этого компонента ВКМ по отношению к общему количеству ВКМ.

В 3D-модели кожи in vitro макромолекулярная скученность или MMC сократила время культивирования с пяти недель до трех, чтобы получить зрелую органотипическую кокультуру кожи. Как видно на рисунке, при окрашивании H и E через три недели культура с MMC состояла из плевристратифицированного эпидермиса и дермы стромольного гребня. Кроме того, в дермальэпидермальном соединении скученных клеточных культур было обнаружено интенсивное и непрерывное окрашивание коллагена seven в контрольных культурах.

Просвечивающая электронная микроскопия также показывает наличие якорных фибрилл в органотипических культурах, полученных с помощью ММК, демонстрируя функциональный коллаген 7. Матрицы, полученные из клеток, могут быть использованы для вторичного посева клеток в качестве альтернативного каркаса, поскольку сложность внеклеточного матрикса сохраняется, и он производится самими клетками. Органотипические культуры кожи, которые генерируются в условиях макромолекулярной скученности, могут быть использованы в качестве улучшенной 3D-модели кожи, поскольку они содержат дерму стромального гребня, крупное дермальеэпидермальное соединение и плевристированный эпидермис.

Органотипические или эквивалентные коже культуры, полученные с помощью высокомолекулярных краудеров, также могут быть использованы для пересадки кожи, поскольку они имеют лучше развитое дермальэпидермальное соединение, что, вероятно, улучшит успех трансплантата. В дополнение к усиленному осаждению внеклеточного матрикса, макромолекулярное скученность может быть применено к другим системам in vitro для усиления реакций с ограниченной скоростью, без необходимости увеличения количества реагентов. Например, полимеразные цепные реакции.