Поток-модель Руководствуясь Изготовление высокой плотности штрих-кода антител Microarray

Общая цель данной методологии заключается в создании массива антител для применения в анализе одиночных клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области анализа одиночных клеток, например, как мы можем обнаружить секретные белки и внутриклеточные белки одновременно из одной и той же клетки. И как мы можем изготовить платформу микромассивов для достижения этой цели.

Главное преимущество этой техники в том, что она является настраиваемой. Варьируя стратегии структурирования потоков, можно создавать массивы различной размерности. Заранее сгенерируйте мастер-сервер SU-8 для шаблонов потока штрихкодов.

Инструкция приведена в текстовом протоколе. Это включает в себя проектирование и изготовление хромированной фото-маски. Нанесение маски на слой фоторезиста и нанесение ультрафиолета обеспечивает рисунок.

Чтобы начать подготовку формы для штрих-кода PDMS, смешайте 40 граммов силиконовой эластомерной основы с четырьмя граммами отвердителя, затем энергично перемешивайте в течение 10 минут. Затем дегазируйте раствор предварительного полимера в течение 20 минут под вакуумом. Затем загрузите раствор в чашку Петри, содержащую кремниевую пластину с мастером штрих-кода SU-8.

Залейте раствор на глубину до 7,45 миллиметров. Затем дегазируйте смесь в чашке, чтобы удалить оставшиеся пузырьки. После дегазации выпекайте смесь в течение часа при температуре 75 градусов Цельсия, чтобы выдержать PDMS.

Далее, разрезая скальпелем, аккуратно снимите форму со штрих-кодом. Затем аккуратно очистите плиту от. Далее обрежьте края плиты, чтобы сделать нужную форму для формы.

Завершите формование с помощью пробивного перфоратора для биопсии с поршнем, чтобы вырезать полумиллиметровые отверстия в круглых элементах узора, которые представляют собой входные и выходные отверстия. После сдувания пыли со стеклянного стекла с покрытием из поли-L-лизина с помощью азотного пистолета прикрепите форму PDMS к предметному стеклу. Аккуратно выровняйте края формы по горке.

Теперь запекайте сборку в течение 90 минут при температуре 75 градусов Цельсия, чтобы укрепить связь между PDMS и слайдом. Тем временем подготовьте 20 штук гибких полиэтиленовых трубок для входных и выходных отверстий. На каждый кусок трубки прикрепите полый штифт из нержавеющей стали диаметром в один миллиметр.

Затем с помощью булавок заполните длину поли-L-лизином на сантиметр или более. После приклеивания к стеклу осторожно закрепите штифты на входных отверстиях формы. Это самый сложный этап подготовки.

Не стоит торопить процесс. Прикрепите другой конец трубок к азотному баку с регулируемым давлением, который состоит из сети из 20 трехходовых клапанов и может работать с двумя формами одновременно. Используя установку, продуйте раствор через форму со скоростью от 0,5 до одного фунта на квадратный дюйм в течение не менее шести часов.

Начните с аспирации свежеприготовленных одноцепочечных растворов ДНК в BS-3 через штифты из нержавеющей стали в полиэтиленовую трубку. Затем соедините форму PDMS с источником азота и пропустите раствор через форму со штрих-кодом в течение примерно 40 минут или пока все каналы не будут заполнены. Затем остановите поток и дайте плесени инкубироваться при комнатной температуре в течение двух часов.

Через пару часов выпекаем форму со штрих-кодом при температуре 75 градусов Цельсия в течение часа. После запекания отсоедините форму от предметного стекла и аккуратно промойте предметное стекло с 01% SDS. Затем трижды промойте предметное стекло ультрачистой водой.

После стирки высушите предметное стекло со штрих-кодом с помощью спиннера. После высыхания храните предметное стекло со штрих-кодом в чистой 50-миллилитровой тубе. Чтобы продолжить, следуйте текстовому протоколу для проверки одномерного шаблона.

Чтобы выполнить процедуру валидации, заблокируйте предметное стекло, гибридизуйте с ним три комплементарные ДНК цианина и измерьте результаты. Ведущее устройство СУ-8 для массива три на три имеет диаграмму направленности, перпендикулярную схеме первой конструкции. Используйте ранее описанный способ для изготовления новой пресс-формы PDMS по этому шаблону.

Для начала сделайте новые рабочие концентрации девяти олигонуклеотидов. Теперь подайте трехпроцентный раствор для блокировки BSA во все 20 каналов слайда массива в течение часа при давлении от 0,5 до одного фунта на квадратный дюйм. Затем загрузите растворы ДНК в соответствующие каналы.

После протекания в течение примерно 40 минут инкубируйте предметное стекло при комнатной температуре в течение двух часов, чтобы ДНК могла гибридизироваться. Затем подайте трехпроцентный раствор для блокировки BSA во все 20 каналов в течение часа. Это приведет к удалению негибридизированной ДНК.

Теперь снимите слайд матрицы с PDMS и один раз опустите слайд в трехпроцентную BSA. Затем дважды опустите предметное стекло в PBS, а затем одно погружение в двухпроцентный PBS. Затем, как и раньше, высушите предметное стекло с помощью спиннера предметного стекла под микроскопом.

Чтобы продолжить, выполните шаг проверки, аналогичный проверке одномерных слайдов. Используйте олигонуклеотиды от одного до девяти простых чисел, все они конъюгированы с цианином три. Сохраните предметное стекло три на три в центрифужной пробирке объемом 50 миллилитров для последующего использования.

В текстовом протоколе далее объясняется, как преобразовать матрицу ДНК в матрицу антител. После приготовления и очистки конъюгатов антитело-олиго подготовьте еще одну форму PDMS с микрокамерами. Подробности см. в тексте.

Сопрягите эту форму со слайдом массива. Теперь заблокируйте предметное стекло одним процентом BSA и выдержите его в течение часа при комнатной температуре. Во время инкубации приготовьте 200 микролитров конъюгатов антитело-олигонуклеотид.

После блокировки добавьте в сетап коктейль антитела-олиго. Дайте антителам инкубироваться на матрице в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия, а затем очистите и высушите предметное стекло, прежде чем приступить к погружениям в предметные стекла, описанным в текстовом протоколе. После выполнения описанного протокола с использованием матрицы три на три полученную панель антител использовали для мультиплексного детектирования, преимущественно с помощью сэндвич-платформы ИФА.

Белки показали менее чем 10%-ную вариацию от одного конца к другому концу предметного стекла. На матрице три на три может быть обнаружено до семи белков вместе с эталоном, меченным цианином три, и отрицательным контролем. В эксперименте с одной клеткой, проведенном для исследования опухоли, все шесть белков были обнаружены одновременно.

Для калибровки рекомбинантные белки были нанесены на матрицу в различных концентрациях. Чувствительность детектирования была довольно схожа с обычным сэндвич-тестом ИФА. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что пресс-формы PDMS не должны содержать твердых частиц

Пыль в каналах может привести к образованию решеток с плохой однородностью и низкой чувствительностью. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области исследований рака к изучению межклеточной сигнализации с использованием моделей опухолевого микроокружения.