Моделирование резистентностью к химиотерапии лейкоз In Vitro

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы лучше смоделировать резистентный острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в лечении рефрактерного ОЛЛ о том, как микроокружение костного мозга влияет на химиотерапевтическую резистентность клеток ОЛЛ. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он значительно дешевле и занимает меньше времени, чем использование традиционных животных моделей для изучения адвокации лекарств на рефрактерных клетках ОЛЛ.

Начните с посева от 5 до 20 умножить на 10-шестую лейкемические клетки в 10 миллилитров опухолеспецифичной питательной среды на 100-миллиметровый планшет с 80-90% сливающимися стромальными клетками костного мозга или остеобластами. Каждый четвертый день наклоняйте пластину в сторону и отсасывайте все, кроме одного миллилитра среды, стараясь не нарушить адгезивный слой клеток. Затем осторожно добавьте девять миллилитров свежей среды для культуры лейкозных клеток по каплям в угол пластины вдоль боковой стороны, чтобы обеспечить минимальное нарушение адгезивных клеток.

После 12-го дня совместного культивирования осторожно пипетируйте питательную среду вверх и вниз по планшету примерно от пяти до 10 раз, чтобы собрать плавающие лейкозные клетки. И переложите клетки в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Затем повторно засейте клетки на новую пластину, состоящую из 80-90% сливающихся стромальных клеток костного мозга, или остеобластов, как показано выше.

К четвертому дню будут сформированы три субпопуляции лейкозных клеток, причем взвешенные лейкозные клетки будут свободно плавать в среде. Лейкозные клетки Phase Bright прилипают к поверхности монослоя адгезивных клеток, а лейкозные клетки Phase Dim мигрировали под монослой. Для приготовления бисерных колонок G10 сначала разогрейте на водяной бане 30 миллилитров среды для клеточных культур на колонку до 37 градусов Цельсия.

Далее с помощью пинцета стяните стекловату в тонкие свободные пряди. И добавьте несколько слоев слегка упакованных прядей в один 10-миллилитровый шприц на необходимую колонку. Когда шприц будет заполнен на 2/3, прикрепите односторонний запорный кран в закрытом положении к наконечнику и закрепите шприц на кольцевой подставке достаточно высоко, чтобы под запорным краном можно было разместить коническую трубку объемом 50 миллилитров

Теперь поместите трубку для сбора под колонку для шприца. И с помощью пипетки объемом 10 миллилитров добавьте капли частиц G10, взвешенных в PBS, поверх стекловаты. Продолжайте добавлять частицы G10 до тех пор, пока не образуется двухмиллилитровая гранула.

Затем добавьте в колонку два миллилитра аликвоты предварительно подогретой среды. И медленно откройте запорный кран, чтобы среда вытекала из колонны по каплям. Когда 10 миллилитров среды полностью стекнут через колонку, закройте запорный кран.

Откажитесь от проточного отверстия и поместите новую сборную трубку под колонну. Чтобы собрать субпопуляцию взвешенной опухоли, аспирируйте среду из планшета для совместной культуры лейкозных клеток и используйте ту же среду для осторожной промывки планшета один раз. Затем перенесите субпопуляцию лейкозных клеток с плавающей суспензией в коническую пробирку объемом 15 миллилитров.

Чтобы собрать субпопуляцию опухоли Phase Bright, добавьте 10 миллилитров свежей среды обратно в планшет для совместной культуры. И промывайте примерно пять раз достаточно энергично, чтобы удалить адгезивные лейкозные клетки, не смещая монослой адгезивных клеток. Затем перенесите субпопуляцию Phase Bright в ее собственную коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Чтобы собрать субпопуляцию опухоли Phase Dim, удалите оставшуюся среду с помощью промывки PBS объемом в один миллилитр. И отделите клетки с тремя миллилитрами трипсина при 37 градусах Цельсия. Через пять минут осторожно постучите по стенкам пластины, чтобы выбить адгезивные клетки, с последующим добавлением одного миллилитра FBS для остановки ферментативной реакции.

Затем промойте сыворотку от трех до пяти раз, чтобы разрушить любые крупные клеточные агрегаты. И перенесите неочищенную субпопуляцию Phase Dim в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров. Когда все субпопуляции будут собраны, раскрутите клетки вниз.

И повторно суспензируйте каждую из гранул в одном миллилитре предварительно подогретой среды. Когда запорный кран полностью закрыт, для каждой субпопуляции используйте пипетку объемом 1000 микролитров, чтобы добавить весь объем клеток объемом в один миллилитр, по каплям, в верхнюю часть одной из подготовленных колонок G10, убедившись, что клетки остаются поверх или внутри гранулы G10. Дайте клеткам инкубироваться на грануле G10 в течение 20 минут при комнатной температуре.

Затем добавьте в колонку от одного до трех миллилитров свежей предварительно подогретой среды. И откройте запорный кран так, чтобы среда медленно выходила из колонн, по каплям. Продолжайте добавлять в столбики предварительно подогретую среду, с шагом в один-два миллилитра.

Когда будет собрано в общей сложности от 15 до 20 миллилитров лейкозных клеток, закройте запорный кран и закупорьте трубку для сбора. Затем раскрутите ячейки вниз и снова суспендируйте гранулу в соответствующем буфере для анализа. После трипсинизации адгезивного клеточного слоя с помощью анализа прямого и бокового рассеяния наблюдаются две различные популяции клеток.

После разделения G10 восстанавливается чистая популяция ВСЕХ клеток. Особый интерес представляет то, что все клетки Phase Dim, восстановленные из стромальных клеток костного мозга или кокультур остеобластов, практически не демонстрируют гибель после воздействия цитотоксической химиотерапии. Пытаясь выполнить эти процедуры, важно помнить о выполнении этих шагов как можно более правильно, чтобы уменьшить любые фенотипические изменения, которые могут возникнуть в лейкозных клетках.

Этот метод предоставляет исследователям в области исследований лейкемии возможность моделировать резистентный к химиотерапии лейкоз в модели in vitro, которая больше напоминает микроокружение костного мозга.