Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов
February 22nd, 2016
Этот протокол представляет собой метод для выполнения количественного, для одной ячейки в месте анализа экспрессии белка изучать спецификации клонов у мышей преимплантационных эмбрионов. Процедуры, необходимые для сбора бластоцисты, вся монтажа обнаружение Иммунофлуоресцентной белков, томография образцов на конфокальной микроскопии и ядерного сегментации и анализа изображений описаны.
Общая цель этого протокола заключается в количественной оценке уровней белка in situ в преимплантационных эмбрионах мышей. Таким образом, этот метод позволяет выполнять высокопроизводительный анализ изображений конфокальной микроскопии с разрешением одиночных клеток в полуавтоматическом режиме. Этот метод может быть использован для количественной оценки концентраций белков на конфокальных изображениях при высокой плотности ядра и при необходимости изучения гетерогенностей в клеточных популяциях.
Для начала используйте открытое пламя на стеклянной пастеровской пипетке, чтобы нарисовать капиллярный конец на кончике. Осторожно потрите дальний конец пипетки о капилляр, чтобы разбить его, создавая при этом тупой конец. После принесения в жертву беременной самки мыши в желаемый эмбриональный день развития, обнажите брюшные органы в соответствии с текстовым протоколом и определите место для матки.
Возьмитесь за цервикальный конец, разрежьте шейку матки и аккуратно потяните вверх, чтобы растянуть оба маточных рога. Срежьте с него жир, стараясь не проколоть стенку матки. Разрежьте над яйцеводами, ниже яичников, чтобы освободить всю матку, и поместите на чашку Петри.
Далее накройте матку PBS, и отделите оба маточных рога, разрезав проксимальный конец с обеих сторон шейки матки. Затем отделите каждый яйцевод от матки, разрезав ниже соединяющего их перешейка. Под диссекционным микроскопом с помощью шприца объемом 1 мл с иглой для подкожных инъекций вымывают бластоцисты из матки в рабочую среду, проталкивая 0,5-1 мл среды через каждый рог из отверстия шейки матки.
Подождите от одной до двух минут, чтобы бластоцисты опустились на дно посуды после смыва. Затем найдите бластоцисты и с помощью стеклянной пастеровской пипетки с капиллярным концом соберите бластоцисты и перенесите свежую каплю среды. После промывки бластоцист удалите zona pellucida с помощью кислого раствора тирода, чтобы кратковременно промыть эмбрионы.
Как только зону перестанет быть видно, переведите бластоцисты обратно в среду для манипуляций. Промойте бластоцисты при комнатной температуре PBS, и зафиксируйте их, переложив до 4% PFA в PBS на 10 минут при комнатной температуре. После фиксации перенесите бластоцисты обратно в PBS для хранения при температуре четыре градуса Цельсия.
После проведения имунофлуоресценции в соответствии с текстовым протоколом с помощью пипетки с тонким ртом сделайте микрокапли PBS или раствора ядерного красителя на стеклянной поверхности 35-миллиметровой посуды со стеклянным дном и покройте их минеральным маслом. Поместите эмбрионы в микрокапли и расположите их последовательным образом, предпочтительно так, чтобы доступ к полости ICM был параллельен стеклянной поверхности, затем установите чашку на держатель микроскопа. Для проведения конфокальной визуализации используйте самую низкую мощность лазера, которая обеспечивает сильное соотношение сигнал/шум без обесцвечивания флуорофоров.
Отрегулируйте набор усиления и выключения для получения максимально широкого динамического диапазона без передержки образца. Захват большей части или всего диапазона оттенков серого облегчит обнаружение небольших различий в интенсивности между изображениями. Следуйте дополнительным деталям, изложенным в текстовом протоколе, чтобы получить изображение эмбрионов по всей оси Z.
Следуйте графическому пользовательскому интерфейсу инструмента сегментации на основе MATLAB Modular Interactive Nuclear Segmentation, или MINS, чтобы загрузить конфокальное изображение или целый стек Z исходных данных, сгенерированных микроскопом. Чтобы просмотреть результат каждого шага, нажмите соответствующую кнопку «Вид». Желтая метка над кнопкой указывает на то, что операция выполняется.
Зеленая метка указывает на то, что операция завершена. Оцените результат этапа обнаружения, прежде чем приступать к сегментации. Если он не устраивает, измените параметры обнаружения и запустите его повторно.
В пакетном режиме «Запустить» нажмите «Добавить файлы» и загрузите все файлы для обработки сразу. Нажмите «Запустить пакетный режим» и дайте программному обеспечению время для обработки файлов. Результаты сегментации будут сохранены в той же директории, что и исходные файлы.
Выявление ложноположительных результатов, таких как апоптотические везикулы или другие элементы, которые не являются интактными ядрами, но которые могли быть идентифицированы как таковые с помощью MINS. Удалите соответствующие записи о ложных срабатываниях из звездной статистики. CSV.
Сохраните исходный файл starstatistics. csv для использования в будущем и отредактируйте только его копию. Если ядро было чрезмерно сегментировано и представлено в виде двух или более ядер, либо объедините записи, усреднив их уровень интенсивности, либо сохраните одну из записей для этой клетки и отбросьте остальные.
Чтобы решить проблему при сегментации, определите события, при которых MINS не удалось обнаружить границу между двумя или более ядрами и сегментировать их как единое целое, или когда ему вообще не удалось обнаружить ядро. Используйте ImageJ для измерения среднего уровня серого для каждого канала в нижних или несегментированных ячейках. Далее найдите медиальный участок нижнего или несегментированного ядра на канале ДНК, с помощью инструмента произвольного выделения, очертите периметр нижнего или несегментированного ядра.
Затем нажмите Control M" или перейдите в меню "Анализ" и выберите "Измерить"Это запишет среднее значение серого для обозначенной области и отобразит его в новом окне. Используя ту же только что выделенную область в канале ДНК, повторите измерение каждого из интересующих флуоресцентных каналов. Результаты будут перевернуты относительно предыдущего в окне результатов измерений.
Затем используйте полученные измерения для замены ошибочных записей в файле starstatistics. csv. Если ядро было недосегментировано, продублируйте его строку, присвойте каждой новой ячейке разные идентификаторы ячеек и введите значения, полученные в ImageJ, в соответствующий столбец.
В этом случае обе ячейки будут иметь общие пространственные координаты. Если митотические ядра должны быть рассмотрены в анализе отдельно, вручную оцените их и добавьте информацию в файл данных. Обратитесь к текстовому протоколу для получения дополнительных инструкций по обработке изображений.
На этом рисунке представлены примеры интактных бластоцист на разных стадиях с расширенной полостью. Здесь показаны примеры хороших антител к ряду ядерных белков, включая CDX2, GATA4, GATA6, NANOG и OCT4. Этот образец был помечен цитоплазматическим белком DAB2, который дает высокое соотношение сигнал/шум.
На этой панели показаны примеры плохого окрашивания для GATA4 с низким отношением сигнал/шум, где образцы были зафиксированы только в течение 10 минут. Это конкретное антитело к GATA4 требует фиксации в течение ночи для обеспечения сильного сигнала. Эти эмбрионы были визуализированы с помощью 40-кратного масляного иммерсионного объектива с NA 1,30 и рабочим расстоянием 0,21 мм. На средних панелях показаны увеличения ICM или отдельных ядер, и можно различить границу между ними.
Нижние панели показывают, что чем более продвинутый эмбрион, тем выше плотность ядра и, следовательно, тем больше вероятность ошибок сегментации. Эти изображения показывают ошибки, которые может совершать MINS, такие как обнаружение ядер апоптоза как живых клеток, чрезмерная сегментация или недостаточная сегментация. Эта последовательность Z-срезов выявляет событие недостаточной сегментации, когда две клетки были идентифицированы как одна.
После освоения этот протокол может быть выполнен за три-четыре дня от начала до конца, с временной нагрузкой от двух до четырех часов в день. При выполнении этой процедуры важно помнить о том, что необходимо быть очень последовательным в условиях эксперимента, то есть в отношении иммунофлуоресцентных протоколов и параметров визуализации. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биологии развития мышей к проведению in situ количественного анализа экспрессии генов и белков в отдельных клетках.
После просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как получить данные изображения, подходящие для количественного анализа экспрессии in situ.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол представляет метод для проведения количественного, одноклеточного анализа in situ экспрессии белков для исследования спецификации линий в предимплантционных эмбрионах мышей. Метод позволяет проводить высокопроизводительный анализ изображений конфокальной микроскопии с разрешением на уровне одиночной клетки.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Эмбриология
- Клеточная биология
Фон
- Количественное определение уровней белков in situ важно для понимания эмбрионального развития.
- Разрешение на уровне одиночной клетки помогает в изучении гетерогенности внутри клеточных популяций.
- Конфокальная микроскопия является мощным инструментом для визуализации клеточных структур.
- Этот метод применим к предимплантционным эмбрионам мышей.
Цель исследования
- Количественное определение концентрации белков в предимплантционных эмбрионах мышей.
- Анализ спецификации линий в раннем развитии.
- Улучшение понимания клеточной гетерогенности в эмбриональных тканях.
Используемые методы
- Сбор бластоцист у беременных мышей.
- Всецелое иммунофлюоресцентное обнаружение белков.
- Визуализация образцов с использованием конфокальной микроскопии.
- Сегментация ядер и анализ изображений для количественной оценки.
Основные результаты
- Успешное количественное определение уровней белков на уровне одиночной клетки.
- Идентификация паттернов экспрессии белков в предимплантционных эмбрионах.
- Развитие понимания спецификации линий в раннем развитии.
- Демонстрация высокопроизводительных возможностей метода.
Выводы
- Этот метод предоставляет надежный подход для изучения экспрессии белков в эмбрионах.
- Он облегчает понимание процессов развития на клеточном уровне.
- Протокол может быть адаптирован для различных белков, представляющих интерес.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative single-cell protein expression analysis in preimplantation embryos enables mechanistic de-risking of lineage specification hypotheses. This approach supports target validation by providing spatially resolved, quantitative data on nuclear markers critical for early developmental pathways. The method enhances predictive confidence in preclinical models by linking molecular heterogeneity to cell fate decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitation of multiple nuclear markers and their spatial coordinates in intact embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying protein expression patterns associated with lineage specification events.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating high-resolution, reproducible data on target engagement in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems with quantitative nuclear fluorescence readouts for downstream compound screening.
- Reproducibility: Enables standardized imaging and segmentation workflows that reduce variability in high nuclear density samples.
- Scalability: Supports platform reuse across embryonic stem cell colonies, differentiating cultures, and cross-species embryos with minimal adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase protein expression dynamics to preclinical validation through spatial and quantitative phenotyping.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in lineage commitment models by resolving heterogeneities within cell populations at single-cell resolution.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by providing objective thresholds for protein co-expression and localization in developmental pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven quantification of protein expression prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through unsupervised nuclear segmentation and multi-channel fluorescence quantification.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs suitable for evaluating compound effects on embryonic protein expression networks.
- Analytics: Generates spatial (XYZ) coordinates and nuclear fluorescence levels per channel, enabling statistical comparison of expression states across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by linking protein expression patterns to lineage specification in disease-relevant developmental models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging and analysis capability for studying cellular heterogeneity in diverse preclinical systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in early lineage decisions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through automated segmentation and minimal user input via MINS software.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in developmental pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative, spatially resolved protein expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, immunofluorescence, and nuclear segmentation software.
- Depends on access to laser scanning confocal microscopes and MATLAB-based MINS tool for 3D image analysis.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, staining, and imaging protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for varying nuclear density and signal-to-noise ratios across model systems.
- Limited by sample availability and the need for optimization when applying to non-embryonic or low-abundance targets.
