Замедленная видеомикроскопия для оценки EYFP-Паркин агрегирование в качестве маркера для сотовых Mitophagy

Общая цель данного метода тайм-лапс видеомикроскопии заключается в отслеживании селективного удаления поврежденных митохондрий, опосредованного белком Parkin, в процессе митофагии. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области молекулярного метаболизма, например, о том, как митофагия влияет на развитие стойких патологических состояний. Основным преимуществом данной методики является то, что она предоставляет очень мощный инструмент для наблюдения за динамикой меченых белков в ходе молекулярных процессов.

Этот метод позволяет получить представление о жизненном цикле митохондрий. Его также можно применять к другим системам, таким как первичные культуры клеток, исследования в области эмбриологии и прогнозирование приоритетности. Иммортализованные эмбриональные фибробласты мыши, использованные в данном исследовании, выращивают в полной среде DMEM на 10-сантиметровой чашке для культивирования тканей при 37 °C в увлажненной атмосфере с содержанием 5% CO2.

Когда клетки достигнут 80% конфлюэнтности, удалите среду с помощью стерильного аспиратора и добавьте 10 мл стерильного PBS. Удалите PBS и добавьте 1 мл 0,25% раствора Trypsin EDTA. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение двух-трех минут до полного отрыва клеток.

Добавьте четыре миллилитра полной среды DMEM и ресуспендируйте клетки. Отберите десять микролитров клеточной суспензии для подсчета с помощью гемоцитометра. Посейте 1×10⁶ клеток в чашку для культивирования тканей диаметром десять сантиметров и инкубируйте в течение 24 часов.

На следующий день однократно промойте клетки раствором PBS и отделите их путем трипсинизации, как было показано ранее. Добавьте 4 мл полной среды DMEM, ресуспендируйте клетки и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл. Центрифугируйте клетки при 250 gs и 4 °C в течение пяти минут.

Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре стерильного PBS. Снова центрифугируйте клетки. Удалите супернатант после второго центрифугирования.

Добавьте 100 µL смеси растворов для электропорации к осадку клеток и осторожно ресуспендируйте осадок путем пипетирования. Затем добавьте в клеточную суспензию 2 µg экспрессионной плазмиды EYFP Parkin и 1 µg экспрессионной плазмиды DsRed2 Mito. С помощью одноразовой пипетки Пастера перенесите раствор в стерильную кювету.

Проведите электропорацию клеток, используя предустановленную программу. Сразу после электропорации добавьте к клеткам 500 µL свежей, предварительно подогретой полной среды DMEM и высейте клетки на чашку для культивирования тканей диаметром 6 см, подходящую для живой визуализации.

Инкубируйте клетки в увлажненной атмосфере с содержанием пяти процентов углекислого газа при 37 °C в течение 24 часов. Перед началом данной процедуры установите температуру в камере микроскопа на 37 °C. Затем приготовьте специальную среду для прижизненной визуализации, смешав следующие компоненты: DMEM без фенола с добавлением десяти процентов FBS, 2 мМ/л L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина.

Предварительно прогрейте среду при 37 °C на водяной бане. Удалите среду из клеток после электропорации с помощью стерильного аспиратора и добавьте 1 mL предварительно прогретой среды для прижизненной визуализации. Инкубируйте планшет в течение 30 минут при 37 °C.

После подтверждения того, что в камере микроскопа установилась стабильная температура 37 °C, подайте в камеру 5% углекислого газа. Осторожно, избегая резких движений или колебаний, поместите планшет с электропорированными клетками в камеру микроскопа.

С помощью интерфейса программного обеспечения настройте микроскоп для детектирования флуоресцентных сигналов от слиянных белков, кодируемых экспрессионными векторами EYFP Parkin и DsRed2 Mito. Откройте программное обеспечение для таймлапс-видеомикроскопии. В верхнем меню выберите FITC для EYFP Parkin и Rhodamine для DsRed2 Mito.

Выберите увеличение 20X. С помощью интерфейса программного обеспечения найдите отдельную клетку, экспрессирующую оба котрансфицированных вектора, и зафиксируйте ее положение. Повторите эту процедуру минимум для 10 клеток для каждого экспериментального условия.

Откройте меню Apps и выберите пункт Multi Dimensional Acquisition. В окне Multi Dimensional Acquisition установите необходимые параметры, такие как количество серий снимков, временной интервал между ними и координаты регистрируемой клетки. Нажмите Acquire, чтобы начать базовую регистрацию обоих флуоресцентных сигналов.

Выполняйте сбор изображений каждые пять минут в течение общего интервала в пятнадцать минут. Во время сбора изображений подготовьте предварительно нагретую среду для живого имиджинга, содержащую карбонилцианид-4-трифторметоксифенилгидразон (FCCP) в концентрации, в два раза превышающей конечную рабочую концентрацию. Прервите процесс сбора данных и аккуратно добавьте один миллилитр предварительно нагретой среды для живого имиджинга с FCCP в планшет внутри камеры микроскопа.

После добавления FCCP важно заново сфокусировать микроскоп перед возобновлением сбора изображений. Перезапустите процесс сбора данных, как описано ранее, и регистрируйте изображения в течение трех часов, используя зафиксированное положение. По завершении сбора данных сохраните все полученные изображения для последующего анализа.

Здесь представлены изображения таймлапса флуоресцентных сигналов EYFP-Parkin и DsRED2-Mito в фибробластах до введения FCCP. Белые рамки обозначают увеличенные области соответствующих панелей справа. В базовые моменты времени EYFP-Parkin, визуализируемый зеленым цветом, гомогенно распределен по всей клетке.

Сеть митохондрий, визуализированная красным цветом, выглядит хорошо взаимосвязанной, на что указывают белые стрелки. После введения FCCP через пять минут наблюдается фрагментация митохондрий вследствие деполяризации мембран. При этом EYFP-Parkin по-прежнему гомогенно распределен по всей цитоплазме.

Через 55 минут после введения FCCP белок EYFP-Parkin привлекается к поврежденным митохондриальным мембранам для запуска процесса митофагии. Перемещение EYFP-Parkin к митохондриальной мембране после введения FCCP показано в этом репрезентативном таймлапс-видео. После освоения эта методика может быть выполнена за два часа при условии соблюдения всех правил.

После своей разработки этот метод открыл перед исследователями в области аутофагии возможность изучать рециклинг митохондрий, позволяя исследовать процесс митофагии как механизм контроля качества митохондрий в клетках.