Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Общая цель этой процедуры заключается в выделении иммунных клеток из ишемизированного мозга мыши для их количественной оценки и фенотипической характеристики с помощью многопараметрической проточной цитометрии. Анализ постишемического воспаления в головном мозге с помощью многоцветной проточной цитометрии обеспечивает глубокое понимание иммунологических процессов, связанных с прогрессированием поражения, восстановлением и общим исходом инсульта. Основным преимуществом этой процедуры является быстрое центрифугирование с градиентом плотности в один этап, которое позволяет выделить большое количество жизнеспособных иммунных клеток из ишемизированного мозга мыши.

Применение этого метода направлено на идентификацию и валидацию новых иммуномодулирующих стратегий лечения, которые могут быть применены в более широком временном окне инсульта. Начните с погружения одного конца перистальтической перфузионной трубки насоса в ледяной HBSS, не содержащий кальция и магния. Закрепите тупую иглу 23-го калибра на другом конце трубки.

И включите насос, чтобы полностью заполнить трубку с HBSS. Затем поместите усыпленную мышь дорсально на доску для вскрытия, встроенную в пластиковый лоток, и приколите передние и задние лапы, вытянутые как можно шире, иглами 20-го калибра. С помощью пары прямых, один на два зубных щипца захватите кожу живота, сделайте боковой разрез через покров и брюшную стенку острыми ножницами Iris, чтобы обнажить печень.

Затем поднимите грудину и с помощью тупого лезвия ножниц с острой тупой диафрагмой прорежьте диафрагму. Продолжайте разрезать боковую грудную клетку с обеих сторон в каудкраниальном направлении, стараясь не повредить легкое, сердце и грудные артерии, и используйте тупые щипцы, чтобы подогнать кожный лоскут. Приколите лоскут к доске для вскрытия и аккуратно отделите сердце от соединительной ткани.

Удерживая сердце тупыми щипцами, затем введите кончик иглы 23-го калибра на конце перфузионной трубки в верхушку левого желудочка, стараясь не травмировать внутрижелудочковую перегородку. С помощью острых ножниц Iris надрежьте правое предсердие и сразу же запустите насос, стараясь не допустить образования пузырьков внутри насоса. Когда печень приобретет светло-кофейный цвет, используйте прямые хирургические ножницы, чтобы обезглавить мышь сразу за черепом.

Затем с помощью ножниц Iris сделайте разрез по средней линии кожи головы. Когда череп станет виден, поместите один кончик острых ножниц радужной оболочки в большое затылочное отверстие и сделайте боковой разрез в кости. Повторите разрез с другой стороны.

Затем с помощью острых ножниц Iris аккуратно разрежьте от той же полости вверх по средней линии, по направлению к носу. С помощью тонких щипцов аккуратно снимите черепные кости с каждого полушария мозга. Затем поднимите мозг с помощью шпателя и с помощью острых ножниц радужной оболочки тщательно рассеките волокна черепного нерва, которые фиксируют его на черепе.

Помещение мозга в 15-миллилитровую трубку, содержащую 10 миллилитров HBSS с кальцием и магнием на льду. Чтобы диссоциировать мозговую ткань в одноклеточную суспензию, сначала с помощью чистого бритвенного лезвия аккуратно удалите ствол мозга и мозговой мозг. Затем используйте еще одно чистое лезвие бритвы, чтобы рассечь мозг, разрезая каждое полушарие вдоль корональной плоскости на три части примерно одинакового размера.

С помощью поршневого конца пятимиллилитрового шприца разомните кусочки мозговой ткани через 100-микронный клеточный фильтр, непрерывно промывая фильтр ледяным HBSS с кальцием и магнием. Затем поместите гомогенизированные ткани на лед. Когда все образцы будут обработаны, сверните клеточные суспензии и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.

Суспендируйте гранулы в одном миллилитре буфера для разложения. Затем переложите клеточную суспензию в двухмиллилитровую пробирку и инкубируйте клетки при медленном непрерывном вращении при температуре 37 градусов Цельсия. Через час просейте клеточную суспензию через сетчатый фильтр с плотностью 70 микрон и тщательно промойте фильтр тремя миллилитрами промывочного буфера, содержащего ДНКазу.

Затем промойте ситечко 15 миллилитрами буфера для промывки, не содержащего ДНКазы, отжимайте клетки и выбросьте надосадочную жидкость. Чтобы удалить клеточный мусор и миелин, повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах комнатной температуры, градиентной среде плотности 25% и перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку. Тщательно перемешайте клетки в градиенте с повторным аккуратным пипетированием.

Затем раскрутите клеточный раствор. В конце разделения осторожно аспирируйте миелиновую оболочку и надосадочную жидкость, не нарушая гранулы, и ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах буфера для промывки, не содержащей ДНКазы. Переложите ячейки в 15-миллилитровую трубку и снова раскрутите их, снова суспензируя гранулу в 100 микролитрах холодного промывочного буфера.

Затем подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего исключения и храните их при четырех градусах Цельсия. Перед началом иммуноокрашивания инкубируйте клетки при температуре 4 градуса Цельсия в течение 10 минут с реагентом, блокирующим рецептор CD26/CD32 Fc против мышей, чтобы предотвратить любое неспецифическое связывание. Затем добавьте представляющие интерес флуорофор-конъюгированные первичные антитела при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут в темноте.

По окончании инкубации промойте клетки в двух миллилитрах проточного цитометрического буфера. Вращаем вниз. Повторно суспендируйте гранулу в 200 микролитрах буфера для проточной цитометрии и храните образцы при температуре четыре градуса Цельсия до проведения проточного цитометрического анализа.

Чтобы количественно определить абсолютное число инфильтрирующих иммунных клеток путем подсчета гранул, переведите точно 40 микролитров проточной цитометрии и 10 микролитров клеточной суспензии в счетную трубку, содержащую известное количество флуоресцентных шариков. Затем инкубируют клеточную и гранулированную суспензию с меченым FITC антителом CD45 при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут в темноте с последующим обратным заполнением счетной трубки 200 микролитрами буфера для проточной цитометрии. Затем сразу же запускают образец на проточный цитометр, записывая шарики, и CD45-положительные клеточные события.

Через 24 часа после окклюзии средней мозговой артерии инфильтрирующие мозг лейкоциты могут быть идентифицированы по их высокой экспрессии CD45. В популяции с высоким уровнем CD45 полиморфноядерные нейтрофилы идентифицируются по экспрессии LY-6G, в то время как Т-лимфоциты демонстрируют фенотип клеточной поверхности с высоким уровнем CD45 и CD3. Остальные клетки с высоким уровнем CD45 можно дополнительно различать по экспрессии CD19 и CD11b.

В то время как CD11b-положительная фракция может быть подклассифицирована на воспалительные моноциты с высоким уровнем Ly-6C и популяцию с низким уровнем Ly-6C, которая включает в себя популяции моноцитов, макрофагов и дендритных клеток. В острой стадии инсульта Ly-6G-положительные нейтрофилы быстро проникают в мозг после окклюзии сосуда. Напротив, частоты CD3-положительных Т-клеток в ишемизированном полушарии снижаются по сравнению с мозгом и контралатеральным полушарием после фиктивной операции.

В CD11b-положительной популяции ишемия головного мозга смещает баланс в сторону сильного преобладания Ly-6C-высокого воспалительного моноцита. Кроме того, общее количество лейкоцитов в инфарктированном полушарии значительно увеличивается по сравнению с контралатеральным полушарием и искусственным хирургическим мозгом, через 24 часа после окклюзии средней мозговой артерии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать иммунные клетки из ишемизированного мозга с помощью механической фрагментации, ферментативного расщепления и центрифугирования градиента плотности, а также как охарактеризовать эти клетки с помощью проточной цитометрии.

После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре часа, если она выполнена правильно. При проведении этой процедуры важно помнить, что общий выход клеток критически зависит от тщательной диссоциации мозговой ткани. Кроме того, необходима достаточная транскардиальная перфузия для предотвращения контаминации инфильтрирующих мозг лейкоцитов невоспалительными циркулирующими иммунными клетками.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ экспрессии генов или анализ цитокинового профиля, чтобы получить дополнительное представление о функциональной значимости отдельных иммунных абсцессов в контексте ишемического инсульта.