Разработка альфа-синуклеина основе Rat модели для лечения болезни Паркинсона с помощью стереотаксической инъекции рекомбинантного аденосателлитные вирусного вектора
28 февраля 2016 г.
В этой рукописи описывается, как вирус-вектор-опосредованная локальная доставка генов обеспечивает привлекательный способ экспрессии трансгенов в центральной нервной системе. В протоколе изложены все важнейшие шаги по выполнению инъекции вирусного вектора в черную субстанцию крысы для разработки животной модели болезни Паркинсона на основе вирусного вектора.
Общая цель этой процедуры заключается в разработке животной модели болезни Паркинсона на основе вирусного вектора с помощью стереотаксической инъекции в центральную нервную систему. Этот метод может быть использован для разработки нормальных животных моделей, которые позволяют проводить доклинические испытания лекарств и могут быть полезны при изучении молекулярного механизма болезни Паркинсона, а также многих других нейродегенеративных расстройств. Основное преимущество этой методики заключается в том, что ее можно использовать для специфического нацеливания на области мозга.
Может быть достигнута высокая экспрессия мозга и что его можно использовать для создания животных моделей в конкретных линиях и видах животных. Были разработаны различные конечные векторные системы. Выбор векторной системы зависит от размера траншеи, которую вы хотите выразить, продолжительности экспрессии генов, звуков, на которые вы хотите нацелиться, и вопросов биобезопасности.
Демонстрировать процедуру будет Аннелис Артгертс, техник из нашей лаборатории. Начните с правильной анестезии восьминедельной самки крысы Вистар в соответствии с утвержденными протоколами. Убедитесь, что хирургическая плоскость анестезии была достигнута путем сжатия каждой лапы и отметьте отсутствие рефлекса отмены.
Затем с помощью имплантатора MicroTransponder поместите MicroTransponder на спину крысы. Убедитесь, что микротранспондер расположен правильно и что можно получить показания. Теперь состригите шерсть на волосистой части головы крысы, и нанесите местный анестетик на кожу головы и уши.
Переложите крысу в колпак для ламинарного потока, а остальную часть процедуры выполните с использованием асептической техники. Поместите крысу в стереотаксическую рамку, закрепив ушные планки, а затем ротовую и носовую планки. Накройте тело крысы бумажным одеялом, чтобы избежать падения температуры тела.
Нанесите глазную смазку, чтобы предотвратить высыхание глаз. Далее продезинфицируйте кожу головы согласно утвержденным процедурам. Здесь используется один процент йода в 70% изопропила.
Сделав небольшой разрез по средней линии волосистой части головы, аккуратно соскребите оболочки на черепе, и промойте солевым раствором. Дав черепу высохнуть, убедитесь, что брегма и лямбда хорошо видны. Теперь наполните шприц для микровпрыска объемом 10 микролитров 30 калибра и 20 милометром рекомбинантным AAV и поместите его на моторизованный микроинжекционный насос, подключенный к стереотаксическому инструменту.
Для специфической транзакции дофаминергических нейронов черной субстанции рекомбинантные AV-векторы являются первым выбором из-за их высоких титров и эффективности для трансдукции дофаминергических нейронов. Проверьте поток, выпустив каплю AAV. Утилизируйте любой высвободившийся AAV в поливалентном чистящем средстве.
Визуально убедитесь, что голова закреплена прямо в каркасе головы. Затем убедитесь, что череп плоский, сначала переместив кончик иглы в сторону брегмы и измерив высоту в этой точке, опуская кончик иглы в дорсально-вентральном направлении до тех пор, пока он не коснется черепа. Повторите процедуру на лямбде.
После возвращения иглы в брегму переместите иглу в переднем заднем и медиальном латеральном направлении в стереотаксические координаты для микроинъекции. Запишите координаты. В месте инъекции измерьте высоту черепа, как и раньше, и следите за тем, чтобы она не отличалась более чем на 0,3 мм от высоты брегмы.
Затем аккуратно просверлите двухмиллиметровое отверстие в черепе. После того, как отверстие просверлено, измерьте высоту твердой мозговой оболочки, чтобы определить точку отсчета, от которой следует применять дорсально-вентральную координату. Проникните в твердую мозговую оболочку с помощью иглы 26 калибра.
Всасывайте любую кровь вместе со стерильной тканью, и приступайте только после того, как все кровотечения остановятся. Теперь медленно опустите иглу предварительно загруженного шприца для микроинъекций в мозг до дорсально-вентральной координаты. И сделайте паузу на одну минуту.
Затем введите три микролитра AAV со скоростью 0,25 микролитра в минуту. После инъекции дайте игле оставаться на месте еще пять минут, чтобы предотвратить обратный поток по дорожке иглы, прежде чем медленно извлекать ее. Прострочите кожу головы с помощью кодированного плетеного полиэстера 3.0 и продезинфицируйте кожу одним процентом йода и 70% изопропила.
Чтобы ослабить носовую и ротовую планки, а затем две ушные планки, аккуратно снять животное со стереотаксического инструмента. В это время вводят анальгезию и, при необходимости, препарат для отмены анестезии. Затем поместите крысу в чистую клетку на нагревательную пластину, установленную на 38 градусов по Цельсию, и внимательно наблюдайте, пока она не проснется.
После хирургического вмешательства кинетика нейродегенерации может быть изучена у всего животного с помощью поведенческих тестов и ПЭТ-визуализации, а после умерщвления — с помощью иммуногистохимических методов. Цилиндрический тест для оценки спонтанного использования передних конечностей был проведен в различные моменты времени после микроинъекции рекомбинантного AAV, экспрессирующего альфа-синуклеин A53T Mutation в черную субстанцию. Через три недели после инъекции значительное двигательное нарушение наблюдалось у крыс, получавших среднюю дозу.
Через четыре недели после инъекции наблюдалось 50%-ное снижение спонтанного использования контралатеральной передней лапы. В то время как контрольные животные, вводившие eGFP, не показали асимметрии в использовании передней лапы. У крыс, получавших более высокую дозу рекомбинантного альфа-синуклеина AAV 2/7A53T, наблюдалось более выраженное ухудшение использования передних лап через 29 дней после инъекции.
Чтобы доказать, что наблюдаемое двигательное нарушение было дофаминозависимым, была введена однократная доза L-добы. Когда тест с цилиндром был повторен через 45 минут после лечения L-дофой, наблюдалось полное восстановление использования передней лапы у животных, вводивших рекомбинантный альфа-синуклеин AAV 2/7A53T. Для наблюдения за кинетикой неинвазивной дофаминергической нейродегенерации нигростриарной формы с течением времени у отдельных животных связывание с транспортом дофамина количественно определяли с помощью позитронно-эмиссионной томографии мелких животных с F-18FECT в качестве радиолиганда.
Связывание DAT значительно снизилось в ипсилатеральном хвостатом будемане рекомбинантного AAV 2/7A53T альфа-синуклеина, вводимого крысам с течением времени. Через 32 дня наблюдалось снижение связывания DAT до 85%. В качестве положительного контроля инъекция нейротоксина 6 OHDA в SN индуцировала 90% потерю связывания DAT в течение семи дней.
Срезы мозга крыс, которым микроинъекции рекомбинантного альфа-синуклеина AAV 2/7A53T с течением времени иммуноокрашивали на тирозингидроксилазу, маркер дофаминергических нейронов. Этот рисунок демонстрирует прогрессирующую потерю дофаминергических нейронов в течение 29 дней после микроинъекции. После освоения этой техники ее можно выполнить за 45 минут.
При попытке выполнить эту процедуру важно использовать высококачественные итоговые векторные совпадения. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как неинвазивная ПЭТ-визуализация, анализ поведения и иммуногистохимический анализ, чтобы определить уровень нейродегенерации и невропатологии. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как выполнять инъекцию вирусного вектора в черную субстанцию для разработки животных моделей на основе вирусного вектора для болезни Паркинсона.
Не забывайте, что работа с вирусными векторами может быть опасной, и что после этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа под ламинарным потоком и надлежащая дезинфекция отходов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной рукописи описывается метод разработки животной модели болезни Паркинсона на основе вирусного вектора посредством стереотаксической инъекции в центральную нервную систему. Этот метод позволяет осуществлять направленную экспрессию генов в конкретных областях мозга, что облегчает доклинические испытания лекарственных препаратов и изучение нейродегенеративных заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Генная терапия
- Нейродегенеративные заболевания
Обзор
- Доставка генов с помощью вирусных векторов является эффективным методом обеспечения экспрессии генов в головном мозге.
- Этот подход позволяет создавать модели животных для изучения таких заболеваний, как болезнь Паркинсона.
- Специфический таргетинг областей мозга повышает релевантность моделей.
- Различные векторные системы могут быть адаптированы в соответствии с исследовательскими целями.
Цель исследования
- Разработать надежную модель болезни Паркинсона на животных.
- Обеспечить возможность доклинических испытаний потенциальных методов терапии.
- Изучить молекулярные механизмы, лежащие в основе болезни Паркинсона.
Используемые методы
- Стереотаксическое введение вирусных векторов в черное вещество.
- Подбор векторных систем в зависимости от размера гена и продолжительности экспрессии.
- Выбор специфических линий и видов животных для разработки моделей.
- Оценка уровней экспрессии генов в головном мозге.
Основные результаты
- Успешная доставка гена в целевые области мозга.
- Создание функциональной животной модели болезни Паркинсона.
- Наблюдаемые высокие уровни экспрессии трансгена.
- Потенциал для дальнейших исследований механизмов нейродегенерации.
Выводы
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для исследования болезни Паркинсона.
- Доставка с помощью вирусных векторов может углубить понимание механизмов нейродегенерации.
- Перспективные области применения могут включать тестирование новых терапевтических стратегий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный протокол позволяет создать таргетную модель болезни Паркинсона у крыс путем стереотаксического введения рекомбинантных векторов AAV в черную субстанцию, что способствует механистическому снижению рисков при изучении патологии альфа-синуклеина. Модель облегчает доклиническую оценку дофаминергической нейродегенерации и терапевтических вмешательств, обеспечивая прогностическую достоверность для валидации мишеней в программах по нейродегенеративным заболеваниям. Благодаря достижению регион-специфической экспрессии трансгена, а также количественным показателям поведения и визуализации, данный подход соответствует рабочим процессам раннего поиска, сосредоточенным на выяснении сигнальных путей и идентификации перспективных соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное выявление и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать дофаминергическую нейродегенерацию, опосредованную альфа-синуклеином, в системе, релевантной заболеванию.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишени за счет регион-специфической экспрессии трансгена и поведенческого фенотипирования.
- Прогностическая ценность: Предоставляет количественные показатели двигательной активности и результаты визуализации, которые коррелируют с потерей дофаминергических нейронов, что способствует доклиническому отбору.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: создание валидированных биологических систем с измеримыми нейродегенеративными фенотипами для скрининга соединений.
- Практическая ценность: обеспечение стандартизированных, воспроизводимых результатов с помощью теста с цилиндром и ПЭТ-визуализации связывания DAT для подготовки к проведению анализа.
- Масштабируемость: возможность повторного использования платформы для различных нейродегенеративных мишеней путем адаптации вектора и координат.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Моделирует прогрессирующую потерю дофаминергических нейронов нигростриарного пути, отражая патофизиологию болезни Паркинсона.
- Механистическое снижение рисков: Устанавливает связь между гиперэкспрессией альфа-синуклеина и дофамин-зависимым поведенческим дефицитом и нейродегенерацией.
- Оптимизация продвижения с учетом рисков: Обосновывает решения о продолжении или прекращении исследований («go/no-go») на основе дозозависимой нейродегенерации и ответа на L-dopa.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс разработки — от валидации мишени и идентификации соединений-лидеров до доклинических испытаний эффективности, что позволяет проводить итеративную оценку механизмов нейродегенерации и терапевтических кандидатов.
- Открытийная биология: Поддерживает проверку гипотез о токсичности альфа-синуклеина и выяснение сигнальных путей в дофаминергических нейронах.
- Скрининг: Позволяет разрабатывать методы анализа с количественными поведенческими и нейровизуализационными конечными точками для оценки соединений.
- Аналитика: Обеспечивает количественную оценку связывания DAT с помощью ПЭТ и иммуногистохимического анализа тирозингидроксилазы в качестве трансляционных биомаркеров нейродегенерации.
- Трансляционные исследования: Связывает молекулярные манипуляции с функциональными результатами, поддерживая преклиническую преемственность.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для моделирования мишеней нейродегенерации с помощью стереотаксического введения вирусных векторов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прогностическая уверенность в валидации мишени путем воспроизведения ключевых фенотипов болезни Паркинсона.
- Операционная ценность: Стандартизированные хирургические и инъекционные процедуры обеспечивают воспроизводимость в различных центрах и исследованиях.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать более ранние, основанные на данных решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет снижения механистической неопределенности при взаимодействии с мишенью.
- Влияние на портфель: Облегчает приоритизацию терапии, направленной на альфа-синуклеин, с учетом рисков на основе данных о зависимости «доза-эффект» и обратимости изменений.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области стереотаксической хирургии, работы с вирусными векторами и анестезии грызунов.
- Зависит от наличия оборудования и инфраструктуры для микротомии, иммуногистохимии, ПЭТ-визуализации и поведенческого тестирования.
- Необходима межгрупповая стандартизация координат, титров векторов и режимов дозирования.
- При адаптации метода следует учитывать выбор промотора, тропность серотипа и дизайн трансгена для различных мишеней.
- Практические ограничения включают вариабельность хирургического вмешательства, диффузию вектора за пределы целевых ядер и видоспецифическую кинетику экспрессии.
