Выделение и проточной цитометрии анализ глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы охарактеризовать и количественно оценить количество мононуклеарных клеток периферической крови, которые проникли в микроокружение опухоли головного мозга на ранних стадиях. Этот метод может помочь решить ключевые вопросы в области иммунологии опухолей головного мозга путем выявления факторов, важных для транспортировки клеток периферического иммунитета в микроокружение опухоли головного мозга. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет получать зависящие от времени количественные данные о количестве и статусе активации лейкоцитов, которые попали в эту ЦНС.

Поместив мышь под наркозом в стереотаксическую рамку, сделайте двухсантиметровый разрез по средней линии над черепом от лобной кости до затылочной кости с помощью лезвия скальпеля. Затем втяните кожу в месте разреза с помощью ретракторов Collibra. После этого опустите микролитровый шприц, оснащенный иглой 33 калибра, непосредственно над ВМА.

Отрегулируйте положение иглы так, чтобы достичь целевого места для имплантации опухоли. Затем с помощью туберкулинового шприца объемом один миллилитр, оснащенного иглой 26 калибра, отметьте это место, после этого аккуратно экскоризовав надкостницу. Просверлите отверстие в черепной коробке в целевом месте с помощью сверла диаметром 0,8 мм до тех пор, пока оно не достигнет нижележащей твердой мозговой оболочки во время сверления.

Применяйте прерывистое давление с последующим быстрым удалением сверла с поверхности черепа, чтобы избежать чрезмерного нагрева и силы. Затем промойте микролитровый шприц 0,9% хлорида натрия в конической полипропиленовой микротрубке объемом 1,7 миллилитра, чтобы убедиться, что игла не забита. Осторожно поверните коническую полипропиленовую микротрубку объемом 0,6 миллилитра, содержащую опухолевые клетки, несколько раз, чтобы полностью восстановить суспензию клеток.

Затем наберите два микролитра клеток в микролитровый шприц и убедитесь, что в шприц не вводятся пузырьки воздуха. Нанесите один микролитр клеток на салфетку с содержанием 70% изопропилового спирта, оставив ровно один микролитр опухолевых клеток в шприце. После этого опустите иглу вниз, пока она не коснется твердой мозговой оболочки.

Затем опустите иглу на 3,5 миллиметра в мозг, а затем медленно и плавно втяните иглу на 0,5 миллиметра. Доставляйте клетки, нажимая на поршень шприца в течение одной-двух минут. Для проведения транскардиальной перфузии у глубоко обезболенной мыши.

Введите тупую иглу в левый желудочек сердца. С помощью небольшой пары ножниц для вскрытия перережьте правое предсердие, чтобы обеспечить обескровливание перфузии, кровеносную систему мыши раствором тиро в течение нескольких минут, пока печень и легкие полностью не побледнеют от недостатка крови. Следите за тем, чтобы большое количество крови не продолжало выходить из правого предсердия.

Перед извлечением алюминиевой ступицы 20 калибра затупите иглу из левого желудочка. После извлечения иглы отсоедините мышь от экструдированного пенополистирольного блока и поверните мышь брюшной стороной вниз. С помощью больших ножниц для вскрытия отделите голову от остального тела.

Затем разрежьте волосистую часть головы по средней линии с помощью небольшой пары диссекционных ножниц, работающих от затылочной кости к рылу, чтобы обнажить черепную коробку. Впоследствии втяните кожу с обеих сторон черепа и надежно удерживайте череп. Используйте пару костных URS, чтобы осторожно прорвать череп, начиная с затылочной кости, и двигаться вперед, чтобы полностью обнажить дорсальную и боковую поверхности мозга.

Забор мозга мыши из черепа без его повреждения может первоначально оказаться затруднительным. Те, кто не знаком с этой техникой, могут захотеть попробовать несколько раз, прежде чем проводить настоящие эксперименты. После того, как черепные кости будут удалены, поверните голову мыши вентральной стороной вверх.

Перережьте черепно-мозговые нервы у основания мозга, чтобы освободить его от черепа. При этой процедуре с помощью чистого лезвия бритвы с одним лезвием изолируйте область мозга, содержащую опухоль, сделав сагиттальный разрез в центре мозга. Чтобы рассечь два полушария, поверните ипсилатеральное полушарие медиальной стороной вниз и сделайте один корональный разрез в мозжечке, а другой — в обонятельной луковице, чтобы изолировать целевую ткань, содержащую опухолевый имплантат.

Затем поместите целевую ткань в маркированную измельчитель для стеклянных тканей, содержащую один миллилитр DPBS. Нажмите на поршень до упора и поверните семь раз, чтобы разрушить ткань. После этого поднимите поршень, чтобы жидкость осела обратно на дно измельчителя тканей.

Повторите этот шаг трижды. Однако поворачивайте поршень только четыре раза во время следующих двух повторов и три раза во время последнего повтора. Чтобы избежать чрезмерного утомления тканей мозга.

Затем нанесите три объема по одному миллилитру ледяного DPBS на боковые стороны поршня, чтобы промыть остатки мозгового вещества в тканевом измельчителе. Затем мы суспензируем мозговое вещество TRID с помощью пипетирования вверх и вниз и помещаем в промаркированную 15-миллилитровую центрифужную пробирку со льдом. Промойте боковые стороны измельчителя пуховых тканей дополнительным одним миллилитром ледяного DPBS и добавьте в ту же 15-миллилитровую центрифужную пробирку.

Держите все пробирки с мозговым веществом TRID на льду, пока не будут обработаны все образцы. Затем раскрутите мозговое вещество TRID в 15-миллилитровых центрифужных пробирках при 740 умноженных на G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Далее удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулированное вещество мозга в одном миллилитре заранее приготовленной смеси коллагеназы и ДНК одного пищеварительного фермента.

Поместите 15-миллилитровые центрифужные пробирки в штатив для пробирок и поместите штатив на водяную баню CS с температурой 37 градусов на 15 минут. Затем осторожно перемешивайте образцы дважды в течение инкубационного периода, переворачивая пробирки, чтобы облегчить дезагрегацию тканей. Впоследствии добавьте по шесть миллилитров тикоса DPBS в каждую трубку, чтобы разбавить пищеварительные ферменты.

Перемещайте его вверх и вниз, чтобы ресуспендировать и отфильтровать общий объем через стерильные 70-микронные нейлоновые сетчатые фильтры в новые 15-миллилитровые центрифужные пробирки с маркировкой на льду. После этого вращайте суспензию клеток мозга в 740 раз G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы получить одну клеточную гранулу. Извлеките 15 миллилитровые пробирки из центрифуги и положите их на лед.

Затем увеличьте температуру на центрифуге примерно до 21 градуса Цельсия в рамках подготовки к следующему этапу. Затем полностью удалите клеточный слой и первоначально повторно суспендируйте клеточные гранулы в одном миллилитре центрифугирующей среды плотностью 70% с помощью микропипетки P 1000. Затем добавьте еще четыре миллилитра центрифугирующего материала 70% плотности в каждую пробирку.

Надежно наденьте колпачки и гомогенизируйте клеточную суспензию, осторожно перевернув пробирку несколько раз, после чего перенесите 15-миллилитровые центрифужные пробирки, содержащие клетки мозга, ресуспендированные в 70% плотности. Центрифугирующие среды от льда до штатива для пробирок при комнатной температуре по одному. Осторожно нанесите два миллилитра раствора центрифугирующего материала 37% плотности на пять миллилитров центрифугирующего материала 70% плотности, чтобы образовать чистую границу раздела между двумя слоями центрифугирующего материала.

Затем отметьте положение границы раздела между двумя слоями маркером с тонким наконечником, чтобы его можно было легко идентифицировать после центрифугирования, когда различие становится менее заметным. Вращайте 15-миллилитровые центрифужные пробирки при 740-кратном перегрузке в течение 20 минут при комнатной температуре без перерыва. Чтобы избежать нарушения границы раздела между слоями фильтрующего материала центрифугирования по плотности, соберите pbmc, скопившийся на границе между двумя слоями центрифугирующего фильтрующего материала плотности, введя в пробирку микропипетку P 200.

Осторожно обойдя липидный слой один раз на уровне полосы PBMC, медленно извлеките 200 микролитров с поверхности слоя центрифугирующего материала плотностью 70% и перенесите на соответствующую маркировку полипропиленовую факсимильную трубку на льду. Повторите этот шаг один раз, чтобы достичь общего объема 400 микролитров на образец. Способность экспериментаторов формировать чистую границу раздела между двумя слоями центрифугирующей среды имеет решающее значение для воспроизводимой изоляции p BMC.

Следует медленно наливать центрифугирующий материал плотностью 37%, наклоняя трубку на 20-30 градусов над столешницей. На этом рисунке показана стратегия гейтирования для типичного эксперимента: гейты, размещенные на GR 1 положительной CD 11 B положительных миелоидных клетках, показанных на пятом шаге и NK 1.1. Положительные естественные клетки-киллеры, показанные на шестом этапе, затем стратифицированы на основе экспрессии GZMB на этапах 5 и 6 прайм соответственно.

На этом рисунке обратное гейтирование GR 1 положительных CD 11 B положительных миелоидных клеток и NK 1.1 положительных естественных киллеров на FSCA в сравнении с SSCA демонстрирует меньший лимфоидный размер естественных киллеров по сравнению с относительно большим размером миелоидной популяции, что обеспечивает дополнительное подтверждение идентичности этих двух субпопуляций pbmc. Приведенные здесь данные показывают, что приживление клеток глиомы GL 26 sital one I в синген. Мозг мыши XC 57 black six J быстро индуцирует набор положительных чисел PBMC CD 45, показанных в связи с каждой точкой данных вдоль кривой GL 26 sit GAL one I представляют собой индукцию складки инфильтрирующей опухоль pbmc над контролем.

Было показано, что GGL 26 сидят в NT-опухолях в указанный час после имплантации опухоли или HPI на основе специфического коктейля антител, используемого в демонстрации GR one, CD 11 B положительных миелоидных клеток и NK 1.1 положительных естественных киллеров специфически проникают в микроокружение опухоли GAL one с дефицитом опухоли в течение 48 часов после приживления опухоли. Тем не менее, общее количество глиом, инфильтрирующих миелоидные клетки, значительно превышает количество естественных клеток-киллеров. После освоения методология очерчивается от сбора мозгов до потока.

Цитометрический анализ может быть выполнен одним экспериментатором примерно за шесть часов. Крайне важно, чтобы весь объем каждого образца PBMC был проанализирован проточным цитометром для достижения справедливого сравнения общего числа комплементарных экспериментов с глиомой, инфильтрирующими pbmc. Такой иммуногистохимический анализ может быть выполнен для получения пространственных данных об инфильтратах иммунных клеток и для измерения общего размера опухоли и микроанатомии в моменты времени, которые соответствуют тем, которые были оценены с помощью данной процедуры.

Этот метод может быть применен для изучения различных моделей опухолей головного мозга, в том числе созданных de novo с использованием онкогена, кодирующего плазменную ДНК, без существенных изменений в общей процедуре. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить суспензии клеток глиомы для стереотакса и трансплантата в мозг мыши, как трансифицировать опухоль, мозг мышей, а также как изолировать и прокачивать цито метрически, анализировать глиому, инфильтрирующую мононуклеарные клетки периферической крови.