Полиграфическая Порядок записи для измерения спать в мышах
25 января 2016 г.
Запись электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и электромиограммы (ЭМГ) у свободно ведущих себя мышей является важным шагом для корреляции поведения и физиологии со сном и бодрствованием. Описанный здесь экспериментальный протокол представляет собой кабельную систему для получения записей ЭЭГ и ЭМГ у мышей.
Общая цель этой процедуры полиграфической регистрации состоит в том, чтобы определить бдительное состояние мышей и измерить время, затраченное на бодрствование, сон с быстрым движением глаз или сон с небыстрым движением глаз. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы почти во всех областях нейробиологии, которые стремятся соотнести поведение и физиологию с активностью нейронов коры головного мозга у животных. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может записывать множество узлов, электроэнцефалограмму и электромиограмму, а также может сочетаться с другими мозговыми имплантатами, такими как оптические волокна и инфузионные канюли.
Визуальная демонстрация этого метода очень важна, потому что имплантация электрода должна быть выполнена правильно, а качество электрода чрезвычайно важно для оценки физического состояния. Демонстрировать процедуру будет Йоко Таката, постдок из моей лаборатории. Перед началом работы простерилизуйте все хирургические инструменты в стерилизаторе с горячими шариками.
Как только подтвердится, что мышь находится под наркозом в результате щипкового пальца ноги, сбрейте волосы на голове и шее. Далее закрепите домик на стереотаксической раме и закрепите голову между двумя ушными планками. Затем нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость.
Приступайте к очищению выбритой кожи скрабами на спиртовой основе и на основе йода. Затем разрежьте по средней линии скальпелем, чтобы обнажить череп, и закрепите кожу сбоку с помощью зажимов, чтобы операционная область оставалась открытой. С помощью твердосплавной фрезы со сверлом 0,8 миллиметра сделайте два отверстия.
Поместите одно отверстие над лобной кортикальной областью. Второе отверстие наденьте над теменной областью правого полушария. Далее с помощью ювелирной отвертки вкрутите в отверстия записывающие винты ЭЭГ из нержавеющей стали.
Вставьте винты всего за два-два с половиной оборота, чтобы получить эпидуральное позиционирование над корой головного мозга. Винты не должны покачиваться после вставки. Это очень важно.
Теперь закрепите электрод в сборе штифтами вверх к черепу. Электроды должны быть прикреплены прямо. Используйте ватный тампон, чтобы зафиксировать положение электрода, и приклейте электрод с помощью цианоакрилата, а затем стоматологического цемента.
Затем сделайте небольшие отверстия в трапеции и вставьте в них электрод ЭМГ. Затем зашите кожу шелковой нитью диаметром 0,1 миллиметра. Теперь извлеките мышь из стереотаксической рамки и поместите ее на грелку.
Делайте мышам внутрибрюшинные инъекции ампициллина и мелоксикама и наблюдайте за мышью до тех пор, пока она не восстановит лежачее положение на грудине. Затем поместите мышь в один дом. Через неделю после вживления электродов перенесите мышь в экспериментальную клетку в звуконепроницаемую камеру звукозаписи.
Закрепите электрод в сборе ЭЭГ/ЭМГ на мыши на записывающем кабеле, подключенном к контактному кольцу. Подключите кабель АЦП к усилителю фильтра сигналов ЭЭГ/ЭМГ, подключенному к контактному кольцу. Используйте АЦП для преобразования сигнала в цифровой сигнал с частотой 128 Гц и, наконец, для записи сигнала на компьютер.
Приучите мышь на два-три дня к камере записи. Если запись ЭЭГ/ЭМГ включает в себя введение лекарств, осторожно обращайтесь с мышью каждый день, когда вводилось лекарство. Затем запустите программное обеспечение для записи ЭЭГ/ЭМГ.
Для начала перейдите на вкладку «Информация о файле данных» и установите флажок рядом с именем файла. Введите имя файла и нажмите кнопку Сохранить. Затем на вкладке Условие записи выберите все каналы ЭЭГ/ЭМГ, которые необходимо записать.
Кроме того, выберите Частота дискретизации на этой вкладке. Теперь во вкладке Информация о канале проверьте, правильно ли отображаются выбранные каналы. После подтверждения запустите запись, выбрав вкладку Настройка таймера.
Затем нажмите «Монитор», чтобы отобразить ЭЭГ и ЭМГ. Если сигналы отображаются корректно, установите часовое время для начала и окончания записи в области Основного таймера. Затем нажмите кнопку «Монитор», чтобы начать запись.
Теперь запишите сигналы в исходных условиях и различных условиях обработки в течение нескольких дней. Когда эксперимент будет закончен, усыпьте мышь пентобарбиталом. Запустите программу для анализа ЭЭГ/ЭМГ.
Откройте исходные данные ЭЭГ/ЭМГ, которые представляют собой файл KCD. Перейдите на вкладку «Сон» и установите время эпохи на 10 секунд. Затем выберите «Мультиэкранирование», чтобы автоматически разделить все десятисекундные эпохи на три этапа на основе амплитуд ЭЭГ и ЭМГ, а также на основе спектрального анализа мощности ЭЭГ.
Далее нажмите на вкладку «Условие БПФ» для ЭЭГ. Там задайте параметры для спектрального анализа мощности. Используйте 256 опорных точек, соответствующих каждым двум секундам ЭЭГ, используйте функцию окна Хэмминга и используйте в среднем пять спектров за эпоху.
Затем нажмите Ok.Now, нажмите Начать скрининг, чтобы начать автоматический скрининг. Затем откройте сохраненные данные, которые сохраняются в формате файла RAF, и проверьте результаты автоматического скрининга. При необходимости корректируйте результаты, если они не соответствуют стандартным критериям.
Чтобы внести исправление, щелкните и удерживайте левую кнопку мыши на неправильно набранной эпохе и проведите курсором по строке неправильно набранных эпох. Отпустите левую кнопку мыши и выберите правильное поведенческое состояние во всплывающем окне. В исходных условиях мыши демонстрировали четкий циркадный ритм сна и бодрствования, соответствующий их ночному образу жизни.
В течение 12-часового светового периода мыши в среднем спали 6,7 часа NREM и 0,9 часа быстрого сна. В то время как в течение 12-часового темного периода бодрствование было преобладающим. Были зафиксированы и другие измерения.
К ним относятся распределение эпох сна, их средняя продолжительность и переходы между стадиями для каждого бдительного состояния. Спектры мощности ЭЭГ для быстрого сна и быстрого сна показывают сильную плотность мощности ЭЭГ в диапазоне частот от 0,5 до 4 герц для быстрого сна по сравнению с плотностью от шести до 10 герц для быстрого сна. Чтобы оценить влияние кофеина на сон, мышей C57 black 6 лечили транспортным средством в один день и кофеином на следующий день.
Внутрибрюшинные инъекции кофеина вводились в начале светового цикла. Как и ожидалось, запись показала, что кофеин увеличивает количество бодрствования у мышей. Трехкратное увеличение бодрствования произошло в течение трех часов после инъекции.
После освоения процедура имплантации электродов может быть выполнена менее чем за 20 минут. Оценка и коррекция данных ЭЭГ за 24-часовой период может быть выполнена примерно за 30 минут. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как настроить запись электроэнцефалограммы и электромиограммы у мышей и как оценить, бодрствует ли животное или спит и как долго.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье подробно описывается процедура полиграфической регистрации для оценки состояния бодрствования свободно передвигающихся мышей с помощью измерений ЭЭГ и ЭМГ. Данный метод позволяет исследователям сопоставлять поведение и физиологию с фазами сна, что дает представление об активности кортикальных нейронов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Электрофизиология
- Поведенческий анализ
Теоретические сведения
- Регистрация электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и электромиограммы (ЭМГ) необходима для изучения сна и бодрствования.
- Данный метод можно сочетать с другими имплантатами в мозг для комплексного сбора данных.
- Правильная имплантация электродов имеет решающее значение для точности измерений.
- Визуальные демонстрации способствуют лучшему пониманию хода хирургической процедуры.
Цель исследования
- Определение состояния бодрствования у мышей.
- Измерение времени, проведенного в различных состояниях сна.
- Корреляция физиологических данных с поведенческими наблюдениями.
Используемые методы
- Полиграфическая запись ЭЭГ и ЭМГ у мышей.
- Использование кабельной системы для сбора данных.
- Хирургическая имплантация электродов в стерильных условиях.
- Визуальная демонстрация процедуры имплантации.
Основные результаты
- Успешная регистрация нескольких физиологических сигналов.
- Возможность оценки сна и бодрствования у свободно передвигающихся мышей.
- Возможна интеграция с другими экспериментальными установками.
- Качество размещения электродов существенно влияет на точность данных.
Выводы
- Этот метод имеет решающее значение для понимания взаимосвязи между поведением и физиологией.
- Он создает основу для будущих исследований в различных областях нейробиологии.
- Правильная техника и оборудование крайне важны для получения достоверных результатов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Точная оценка состояний сна и бодрствования в доклинических моделях необходима для снижения рисков при разработке лекарственных кандидатов, нацеленных на ЦНС, путем установления связи между поведенческими фенотипами и лежащей в их основе нейронной активностью. Данный метод полиграфической записи позволяет проводить количественный лонгитюдный мониторинг состояний бодрствования у свободно передвигающихся мышей, что способствует механистической валидации соединений, модулирующих сон. Этот метод обеспечивает трансляционную непрерывность от взаимодействия с мишенью до функционального результата, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки на ранних этапах поиска новых препаратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, соотнося состояния сна, определенные по ЭЭГ/ЭМГ, с фармакологическими или генетическими манипуляциями.
- Операционная ценность: способствует валидации функциональных мишеней посредством объективных, количественно определяемых измерений состояния бодрствования, что снижает механистическую неопределенность.
- Прогностическая ценность: обеспечивает получение данных о зависимости «доза-эффект» и временном ходе процессов, что повышает уверенность в воздействии на мишень и модуляции сигнального пути.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных высокоточных сигналов ЭЭГ и ЭМГ, подходящих для конвейеров автоматизированной оценки с использованием спектрального анализа и амплитудных порогов.
- Количественные данные: обеспечивает классификацию бодрствования, NREM- и REM-сна на основе эпох, что позволяет проводить воспроизводимые межгрупповые сравнения.
- Масштабируемость: совместимость с установками для хронической регистрации позволяет проводить лонгитюдную оценку при различных условиях лечения и циркадных циклах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует архитектуру сна человека с помощью количественных показателей NREM- и REM-сна, что позволяет проводить исследования нарушений сна и нейропсихиатрических заболеваний.
- Соответствие трансляционным биомаркерам: Сдвиги в спектре мощности ЭЭГ (дельта-ритм 0,5–4 Hz для NREM-сна, тета-ритм 6–10 Hz для REM-сна) служат количественными биомаркерами переходов между состояниями сна.
- Оценка прогресса с учетом рисков: Данные о распределении циклов сна и бодрствования используются для профилирования доклинической безопасности и эффективности, особенно для соединений, активных в ЦНС и влияющих на уровень бодрствования или седацию.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки — от проверки гипотез до оптимизации соединений-лидеров, обеспечивая физиологические показатели, которые связывают молекулярное воздействие с поведенческим ответом при разработке нейропсихиатрических препаратов.
- Фундаментальная биология: облегчает проверку гипотез при исследовании нейронных цепей, регулирующих бодрствование и переходы между сном и бодрствованием, посредством клеточно-специфических манипуляций в сочетании с физиологическим мониторингом.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимый мониторинг состояния бдительности, готовый к проведению анализов, для оценки влияния соединений на архитектуру сна в течение 24-часовых циклов.
- Аналитика: спектральный анализ мощности и автоматизированная оценка эпох позволяют получать количественные, сравнимые данные для оценки вызванных препаратами изменений продолжительности и фрагментации сна.
- Трансляционные исследования: способствует обеспечению преемственности с доклинической валидацией путем моделирования фенотипов ЭЭГ сна человека и циркадной регуляции в генетически доступной системе.
- Повторное использование ресурсов: многократно используемая хирургическая и регистрирующая инфраструктура позволяет проводить лонгитюдные исследования в рамках нескольких проектов, снижая трудозатраты на подготовку каждого отдельного исследования.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в валидации мишени за счет уменьшения неопределенности в интерпретации связи между молекулярными эффектами и функциональными результатами цикла сон-бодрствование.
- Операционная ценность: стандартизированные рабочие процессы имплантации электродов и регистрации сигналов повышают воспроизводимость результатов между различными лабораториями и экспериментальными сериями.
- Стратегическая ценность: позволяет на более ранних этапах выявлять побочные эффекты в ЦНС, что повышает эффективность использования капитала и снижает процент неудач на поздних стадиях из-за непредвиденных нарушений сна.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации соединений с учетом рисков на основе профилей влияния на сон-бодрствование, согласовывая решения о дальнейшем продвижении препаратов с учетом терапевтического индекса.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области стереотаксической хирургии, регистрации сигналов ЭЭГ/ЭМГ и спектрального анализа для стадирования сна.
- Зависимость от стабильной инфраструктуры регистрации, включая токосъемники (слип-ринги), усилители и программное обеспечение, способное выполнять анализ ЭЭГ на основе БПФ и автоматическую классификацию состояний.
- Необходима межгрупповая стандартизация размещения электродов, параметров фильтрации и критериев оценки для обеспечения сопоставимости данных.
- При адаптации метода следует учитывать необходимость корректировок для разных линий мышей, разного возраста или коморбидных моделей, которые могут изменять базовую архитектуру сна или качество сигнала.
- Практические ограничения включают время восстановления после операции, поведенческие ограничения, связанные с использованием кабелей, а также необходимость привыкания к камерам регистрации для минимизации фрагментации сна, вызванной стрессом.
