Инициирование дифференциация в увековечена МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ ушные клетки-предшественники

Общая цель этой процедуры заключается в дифференцировке иммортализованных мультипотентных клеток-предшественников отической системы в типы клеток внутреннего уха. Таким образом, этот метод может помочь нам решить ключевые вопросы слуховой регенерации, такие как то, как отические предшественники могут стать волосковыми клетками улитки или слуховыми нейронами. Важно отметить, что этот метод обеспечивает клеточную систему in vitro, которую можно использовать параллельно с модельными системами in vivo на животных животных.

Сегодня процедуру будут демонстрировать Азаде Джадали, постдокторант в моей лаборатории, а также Чжичао Сонг и Алехандра Лауреано, два аспиранта лаборатории. После приготовления питательной среды, как описано в текстовом протоколе, используйте три миллилитра этой жидкости, чтобы поместить один умножить на десятую до шестой иммортализованных мультипотентных клеток-предшественников, или IMOP, в 60-миллиметровую чашку для культуры тканей. Инкубируйте клетки в течение пяти-семи дней при температуре 37 градусов Цельсия с пятью процентами углекислого газа.

Через день удваивайте объем жидкости в культуре, добавляя свежую среду. Чтобы пройти клетки, сначала перенесите их из чашки для культивирования в коническую трубку объемом 15 миллилитров. А затем поместите трубку при температуре 37 градусов Цельсия на пять-десять минут.

В течение этого времени следует ожидать, что колониеобразующие отосферы соберутся на дне конических зон с помощью гравитационного осаждения. Далее аспирируйте надосадочную жидкость, стараясь не нарушить палитру. Ресуспендируйте отосферы, добавив 0,5 миллилитра предварительно приготовленного предварительно подогретого, одного миллимолярного ЭДТА-улучшенного сбалансированного раствора соли или HBSS, а затем пипетируя вверх и вниз два-три раза.

Чтобы облегчить диссоциацию отосфер на отдельные клетки, поместите коническую в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия. Периодически перемешивайте раствор и, когда отосферы не наблюдаются в виде осадка на дне пробирки, переместите его до комнатной температуры. Продолжайте добавлять в клетки два миллилитра питательной среды для нейтрализации ЭДТА.

И центрифугировать их при комнатной температуре в течение пяти минут при 200 г. Затем аспирируйте разведенный раствор ЭДТА и промойте клетки в пяти миллилитрах 1x PBS. После вращения ячеек вниз с использованием тех же настроек, аспирируйте 1x PBS.

Далее в коническую добавляют 0,5 миллилитра питательной среды. И снова подвешиваем палитру ячеек. Для подсчета разведите клетки IMOP один к ста в питательной среде.

Затем добавьте 75 микролитров этого раствора в кассету, расположенную в микрофлюидном счетчике частиц, и определите количество клеток. После этого поместите один раз на десять-шестую клетки IMOP в чашку для культуры тканей диаметром 60 мм, как описано выше, и повторяйте эту процедуру пассирования каждые пять-семь дней. Через три дня после нанесения покрытия используйте гравитационное осаждение для сбора отосфер, как показано ранее.

Приступайте к аспирации надосадочной жидкости. И мягко ресуспендировать клетки в двух миллилитрах среды для дифференцировки сенсорного эпителия. Затем с помощью пипетки с большими порами объемом десять миллилитров перенесите отосферы в новую 60-миллиметровую посуду.

Дифференцируйте отосферы в течение десяти дней. Добавляя в культуру два миллилитра свежей среды для дифференцировки через день. После этого снова соберите отосферы с помощью гравитационного осаждения.

И отсасывайте отработанную среду. Далее зафиксируйте отосферы в четырехпроцентном параформальдегиде в 1x PBS в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем удалите раствор формальдегида и промойте клетки в 1x PBS, содержащем 0,1% Тритона x100.

Продолжайте блокировать отосферы в 1x PBS с добавлением 10% козьей сыворотки и 0,1% Triton x100. Через час замените блокирующий буфер на буфер, содержащий соответствующее разведение антител Cdkn1b или CDH1. Затем инкубируйте клетки в первичном антителе в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

А на следующий день продолжают иммуноокрашивание с использованием флуоресцентно меченых вторичных антител, фаллоидина и Хёхста, как описано в другом месте. Чтобы подготовиться к визуализации, поместите монтажный носитель на предметное стекло. А затем ввести в среду окрашенные отосферы.

Далее сверху на образец укладываем покровный листок. Дав монтажному материалу высохнуть в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, поместите предметное стекло на предметный столик инвертированного микроскопа, оснащенного 16-битной ПЗС-камерой. С помощью воздушного объектива 20x 0,75 можно получать эпифлуоресцентные изображения, собирая данные из синего, зеленого, красного и инфракрасного каналов.

Во-первых, очистите круглые стеклянные крышки, поместив их в стерильную 100-миллиметровую пластину и погрузив в 70-процентный этанол. Осторожно перемешайте крышки, чтобы убедиться, что они накрыты, и оставьте блюдо при комнатной температуре на десять минут. Далее промойте чехол листы трижды в стерильной 1x PBS, а затем один раз стерильной водой.

Затем дайте чехлу высохнуть, подвергнув их воздействию ультрафиолетового света в вытяжке для культуры тканей в течение 15 минут. Для немедленного использования поместите по одной стерильной крышке в каждую лунку 24-луночного планшета. И осторожно встряхните пластину, чтобы убедиться, что все крышки лежат ровно.

Затем покрыть покровные листы, добавив в каждую лунку 0,25 миллилитров 1x PBS, содержащего 10 микрогам на миллилитр поли-D лизина. После того, как планшет выдержал в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, удалите поли Д раствор лизина и трижды промойте лунки стерильным 1x PBS. После того, как жидкость из последней промывки будет аспирирована, введите по 0,25 миллилитров 1x PBS, содержащего 10 микрограммов ламинина на миллилитр, в каждую из 24 лунок.

После инкубации пластины в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия аспирируйте раствор ламинина, затем промойте каждую лунку одним миллилитром 1x PBS три раза, но оставьте PBS от последней промывки в лунках до тех пор, пока ячейки не будут готовы к нанесению на пластины. Чтобы начать дифференцировку нейронов, подсчитайте клетки из диссоциированных отосфер, как описано ранее. А затем ресуспендировать их в предварительно разогретую среду для дифференцировки нейронов.

Продолжайте засевать от одной до одной целой пять раз от десяти до пятой ячеек IMOP в каждую лунку пластины, содержащей покрытые покровные стекла. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия с пятью процентами углекислого газа. Замена среды дифференцировки нейронов через день.

Через семь дней отсадите среду и зафиксируйте клетки, которые должны быть прикреплены к покровным стеклам, добавив в каждую лунку по четыре процента формальдегида. И оставляем их на 15 минут при комнатной температуре. Затем удалите формальдегид и промойте клетки один раз в 1x PBS, содержащем 0,1 процента Тритона x 100.

Далее снимите буфер для стирки. И добавьте в каждую лунку блокирующий буфер, состоящий из 1x PBS, содержащего десять процентов обычной козьей сыворотки, и 0,1 процента Triton x100. Оставьте клетки на один час при комнатной температуре.

А затем удалите жидкость и замените ее блокирующим буфером, содержащим соответствующее разведение антител Cdkn1b или Tubb3. После ночной инкубации при четырех градусах Цельсия промойте клетки один раз 1x PBS, содержащим один процент тритона x100. А затем приступайте к иммуноокрашиванию, как описано ранее.

После того, как окрашивание будет завершено, выполните окончательную промывку, добавив в лунки 1x PBS. Чтобы подготовить их к анализу, снимите с 24-луночной пластины покровные листы, к которым прикреплены окрашенные клетки. И поместите их на монтажный носитель на предметное стекло.

Дав монтажному материалу высохнуть в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия, получите эпифлуоресцентные изображения, как описано ранее. Отосферы, культивируемые в течение десяти дней в среде для дифференцировки эпителия, демонстрируют повышенную экспрессию Cdkn1b, циклозависимого ингибитора киназы и маркера дифференцировки внутреннего уха, по сравнению с недифференцированными клетками. Здесь окрашивание Хёхста действительно отмечало ядра клеток.

Эти клетки также демонстрируют морфологические изменения в актиновых филаментах и областях межклеточной адгезии, характерных для эпителия. На это указывает появление фаллоидина и мечение Cdh1 на периферии клеток. Отосферы также могут быть направлены на формирование нейронов.

Это яркое изображение поля показывает, что после семи дней в среде для дифференцировки нейронов клетки IMOP проявляют нейриты. Иммуноокрашивание этих клеток нейрональным маркером Tubb3 подтверждает их дифференцировку. И они также надежно экспрессируют Cdkn1b.

Это говорит о том, что двойной сигнал Tubb3, Cdkn1b может быть использован в качестве индикатора дифференцировки нейронов в клетках IMOP. Флуоресцентные дифференцированные и недифференцированные клетки Cdkn1b также нормализовали путем определения его отношения к сигналу Хёхста, что дало количественные результаты. Гистограммы этих данных приведены здесь.

Процентное соотношение недифференцированных и дифференцированных клеток IMOP выше заданного порога нормализованного Cdkn1b представлено на этих графиках. Обе дифференцированные популяции демонстрируют значительное увеличение процента клеток, экспрессирующих Cdkn1b, по сравнению с недифференцированными контрольными группами, что подтверждает дифференцировку, предложенную иммунофлюоресценцией. После освоения рутинное культивирование и дифференцировка клеток IMOP могут быть выполнены за 30 минут, если они выполнены правильно.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как инициировать дифференцировку клеток IMOP. Спасибо, что посмотрели это видео. И удачи в ваших экспериментах.