Половые различия в мышином гиппокампа астроцитов после

Общая цель данной методики заключается в подготовке обогащенных половозвисимых культур астроцитов гиппокампа новорожденных мышей для изучения специфической роли астроцитов в зависимости от пола после кислородно-глюкозной депривации и реоксигенации, что позволяет имитировать гипоксическую ишемию in vivo в условиях клеточной культуры. Данный метод может помочь в поиске ответов на ключевые механистические и трансляционные вопросы, касающиеся половозвисимой роли астроцитов гиппокампа при гипоксической ишемии в развивающемся мозге самцов и самок. Извлеките мозг из головы новорожденного мышонка, используя маленькие ножницы для выполнения срединного разреза кожи в направлении сзади наперед для обнажения черепа.

Осторожно разрежьте череп по средней линии от шеи к носу. Используйте стерильный пинцет с плоскими кончиками, чтобы отслоить кости черепа. Удалите ствол мозга с помощью изогнутого пинцета и перенесите оставшуюся часть мозга в чашку для диссекции.

С помощью изогнутого пинцета переверните мозг так, чтобы вентральная поверхность была обращена вверх, затем разделите полушария острым стерильным хирургическим лезвием. Используя плоский изогнутый пинцет, отогните полушария головного мозга и осторожно удалите выступающую ткань среднего мозга и таламуса, чтобы обнажить гиппокамп — небольшое образование в форме морского конька, расположенное в медиальной височной доле. Извлеките обе доли гиппокампа и аккуратно удалите мозговые оболочки и фибробласты с поверхности долей, подтягивая их тонким пинцетом.

Перенесите обе доли гиппокампа одной мыши во вторую чашку, наполненную примерно 5 миллилитрами HBSS, и поместите на лед. Измельчите доли примерно 4 раза с помощью острого стерильного хирургического лезвия. Используя стерильную пипетку объемом 1 миллилитр, перенесите HBSS и ткань в стерильную коническую пробирку объемом 50 миллилитров, затем центрифугируйте при 300 ×g в течение 5 минут.

После центрифугирования аспирируйте супернатант. Добавьте 3 milliliters 0.25% трипсина, перемешайте и инкубируйте ткань при 37 °C в течение 20 минут при осторожном встряхивании. После инкубации центрифугируйте пробирку при 300 ×g в течение 5 минут.

После центрифугирования осторожно аспирируйте супернатант с помощью стерильной стеклянной пипетки, затем добавьте 10 мл предварительно нагретой среды для посева астроцитов. Тритюрируйте 20–30 раз, используя стеклянную пипетку с оплавленным концом. После повторного центрифугирования в течение 5 минут при 300 ×g аспирируйте супернатант и добавьте 2 мл среды для посева астроцитов.

Пропустите клеточную суспензию через фильтр с ячейками 70 micron в новую коническую пробирку объемом 50 milliliter. Перенесите всю клеточную суспензию в покрытый стерильный культуральный флакон T-25, содержащий 3 milliliters среды для посева астроцитов. Инкубируйте флакон при 37 degrees Celsius в инкубаторе с 5% carbon dioxide.

На следующий день с помощью светового микроскопа оцените степень слияния астроцитов, аспирируйте среду и замените ее 2 миллилитрами свежей среды для посева астроцитов. Примерно на 11-й день культивирования in vitro соберите слившиеся астроциты, аспирировав среду и добавив 2 миллилитра 0,25% trypsina. Осторожно несколько раз переверните флакон, затем аспирируйте трипсин с помощью стерильной стеклянной пипетки.

Добавьте еще 2 milliliters 0.25%трипсина и оставьте флакон при комнатной температуре на 4-5 минут. После удаления трипсина поместите флакон в инкубатор при 37 degrees Celsius и 5%CO2 на 10 минут. После инкубации добавьте 5 milliliters среды для посева астроцитов и отделите слой астроцитов, постучав по флакону 3-4 раза.

Осторожно тритурируйте клеточную суспензию по дну колбы до полного открепления клеток, после чего соберите астроциты в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 300 ×g в течение 5 минут. Аспирируйте супернатант, затем добавьте 1 миллилитр свежей среды для посева астроцитов.

Добавьте 10 µL клеточной суспензии в гемоцитометр и с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа с объективом 10x подсчитайте количество клеток в большой центральной области с сеткой. Разбавьте клетки примерно до 1 × 10⁵ клеток на 2 мл среды для посева астроцитов. Перенесите пипеткой 2 мл клеточной суспензии на стеклянный покровное стекло, покрытое поли-D-лизином, в лунку 24-луночного культурального планшета.

Инкубируйте при 37 °C в инкубаторе с 5% содержанием углекислого газа. Чтобы начать процесс кислородно-глюкозного голодания, аспирируйте среду с покровного стекла с адгезивными астроцитами и однократно промойте 1 мл изотонического раствора OGD. Добавьте в лунку 0,2 мл раствора OGD и поместите в гипоксический инкубатор.

Осторожно перемешивайте на орбитальном шейкере при 50 об/мин в течение первых 30 минут гипоксии. Для реоксигенации замените раствор OGD на 2 мл среды для посева астроцитов и инкубируйте в атмосфере 5% углекислого газа и атмосферного воздуха при 37 °C в течение 5 часов. На данном иммунофлуоресцентном изображении показана чистота первичной культуры астроцитов гиппокампа мыши.

Культуру астроцитов подвергли иммуноокрашиванию для визуализации маркера дендритов нейронов MAP2 (красный цвет) и маркера микроглии IBA1 (зеленый цвет). Ядра окрашены DAPI, который отображается синим цветом. Стрелка указывает на загрязнение микроглией.

На этом репрезентативном изображении иммунофлуоресценции культивируемых астроцитов гиппокампа в условиях нормоксии красным цветом показана иммунореактивность к GFAP, а зеленым — метки HIF1-alpha. Ядра снова окрашены DAPI, который отображается синим цветом. Стрелка указывает на низкий уровень экспрессии HIF1-alpha.

После 2 часов депривации кислорода и глюкозы и 5 часов реоксигенации экспрессия HIF1-alpha в культивируемых астроцитах гиппокампа повысилась, о чем свидетельствует наконечник стрелки, указывающий на повышенную ядерную экспрессию HIF1-alpha. Экспрессия GFAP и экспрессия S100b были повышены в культурах астроцитов гиппокампа самцов мышей после депривации кислорода и глюкозы и реоксигенации. Повышение экспрессии S100b и GFAP также наблюдалось в астроцитах, полученных от самок мышей.

После выполнения данной процедуры для получения ответов на дополнительные вопросы, такие как половые различия в экспрессии определенных генов и белков после ишемии in vitro, можно провести другие методы анализа, включая количественную ПЦР, вестерн-блоттинг, использование siRNA и иммуногистохимическое окрашивание. После разработки эта методика позволит исследователям в области нейробиологии изучать эффекты и последствия инсульта в гиппокампе, исследуя астроциты в культуре.