Убыт- и Gain-оф-функции подход к расследованию Early Cell Судьба определителям предимплантационной эмбрионов мыши

Общая цель этого протокола заключается в использовании манипуляций с потерей и приобретением функции для идентификации специфичных для стадии молекул, которые контролируют внутреннюю дифференцировку клеточной массы эмбрионов мышей во время преимплантации. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос о раннем освобождении клеточной судьбы в фундаментальной биологии развития, а также в биологии стволовых клеток, зоотехнии и репродуктивной биотехнологии, такой как клонирование животных. Основная цель данной методики заключается в том, чтобы стадийно-специфичный рецептор, а также лиганды с использованием усиливали экспрессию только эмбрионального фактора, специфичного для стволовых клеток, во время развития эмбриона.

Этот протокол был разработан в сотрудничестве с несколькими лабораториями. Так что демонстрировать этот процесс будут мои коллеги, профессор Сан Джин Ли, и его аспирант Ён Иль Чо. Через 18-20 часов после последней инъекции принесите беременных самок в жертву интоксикации углекислым газом с последующим вывихом шейки матки.

Затем откройте заднюю часть и прорежьте внутренний слой тонкими ножницами. Найдите и возьмите рога матки с помощью тонких щипцов и аккуратно вытащите их из полости тела вместе с маткой, яйцеводом, яичником и жировыми пакетами. Далее разрежьте область между яйцеводом и завязью с помощью тонких ножниц.

Затем переместите щипцы и разрежьте матку возле яйцевода, оставив прикрепленным не менее одного сантиметра верхней части матки. Теперь перенесите ампулу яйцевода в покрытую минеральным маслом каплю M16 на 35-миллиметровую чашку Петри при комнатной температуре. Объедините яйцеводы от нескольких мышей в одной посуде.

После подготовки одной иглы шприца СС, как указано в текстовом протоколе, с помощью тонких щипцов удерживайте и вводите конец яйцевода. Затем аккуратно проколите и выдавите кумулюсную массу в фазе капли среды. Под стереомикроскопом извлеките 2-PN эмбрионы вместе с окружающими кумулюсными массами с помощью стерильной стеклянной пипетки и перенесите их в новую чашку Петри.

Затем диссоциируйте кумулюсные клетки, омыв ткани в одном миллилитре раствора гиалуронидазы. Теперь инкубируйте блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти-10 минут. Следующим шагом является обнажение эмбрионов.

С помощью стеклянной пипетки аккуратно налейте раствор ванны, чтобы освободить кумулюсные клетки от окружающих эмбрионов. Затем промойте оголенные эмбрионы от 30 до 50 миллилитров свежего PBS на эмбрион. Выполните такую промывку три раза.

Теперь перенесите эмбрионы в 35-миллиметровую пластиковую чашку с M16 плюс BSA и держите их во влажном инкубаторе до четырех часов перед микроинъекцией. Перед микроинъекцией коротко промойте оголенные 2-PN эмбрионы одним миллилитром свежего М16. Затем перенесите эмбрионы в растворе в центрифужную пробирку и вращайте их при давлении 1000 G в течение 10 минут.

Теперь перенесите каждый эмбрион в чашку для культивирования с 20-30 микролитрами среды M16. Это сделает пронуклеусы видимыми. Покройте среду тонким слоем минерального масла и инкубируйте эмбрионы при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение одного-двух часов.

Тем временем с помощью механического съемника подготовьте пипетки для инъекций и держа пипетки из капиллярной трубки из боросиликатного стекла. Затем с помощью микрошлифовального станка и микрофальцевального станка изготовьте инъекционные пипетки с тупыми наконечниками и отполируйте их до отверстий шириной в два микрона. Длина кончика должна быть менее 500 мкм.

Аналогичным образом изготовьте пипетки для удержания, сделав тупые наконечники и отполировав их отверстия до внутреннего диаметра 20 микрон и внешнего диаметра 100 микрон. Теперь загрузите в инъекционные пипетки не менее 200 нанолитров плазмидного раствора в концентрации один микрограмм ДНК на микролитр. Далее смонтируйте инъекционный пипетку в моторизованный микроманипулятор.

Затем установите инжектор на импульсную мощность около 10 пиколитров. Для микроинъекции обезопасьте эмбрионы с помощью отрицательного давления из пипетки. Затем подойдите вперед и поместите кончик пипетки для инъекций, прилегающий к клеточной мембране, чуть выше одного из пронуклеусов.

Затем пронзите клеточную мембрану, протолкните дальше в пронуклеус и сделайте инъекцию 10 пиколитера. После микроинъекции соберите введенные эмбрионы и трижды промойте их свежей средой M16. Продолжительность каждой стирки может составлять менее минуты.

Затем приступайте к культивированию эмбрионов, покрывая среду M16 каплей минерального масла, чтобы предотвратить ее испарение, и помещая каждый эмбрион в пластиковую чашку для культивирования на каплю среды M16. Каждые 24 часа наблюдайте за эмбрионами с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с оптикой DIC 488 нм или 555 нм при 200-кратном увеличении. Неогенин временно экспрессируется на ранних стадиях развития преимплантации.

Он появляется уже на стадии 2 клеток, и длится до ранней стадии морулы. Его экспрессия в основном пространственно ограничена внешними пределами клеток. Уровни экспрессии неогенина манипулировали путем микроинъекций 2-PN зигот с векторами кДНК неогенина или векторами, содержащими короткую РНК шпильки против неогенина.

RFP и GFP были совыражены в качестве индикаторов. Полученный уровень экспрессии неогенина был подтвержден как методом иммунофлуоресценции, так и иммуноблоттинга. Не было никаких грубых морфологических различий ни в потере неогенина, ни в приросте неогенина, и они не развивались по-разному до стадии бластоцисты.

Тем не менее, развитие ВКМ было менее выраженным у эмбрионов с потерей неогенина, что оценивалось по третьим и четырем положительным клеткам ВКМП в октябре. Кроме того, в течение 3 октября и 4 октября было обнаружено больше положительных ICM-клеток на бластоцисту в эмбрионах с неогениновым усилением. Это наблюдение было в дальнейшем подтверждено анализом ПЦР.

В эмбрионах неогенина экспрессия Oct 3 и 4, SOX2 и Nanog была резко увеличена, в отличие от незначительного изменения экспрессии Cdx2 и Tead4. После освоения этой микроинъекционной части этого протокола можно завершить примерно за один час. При использовании этого протокола имейте в виду, что эмбрионы 2-PN являются замороженными микроинъекциями, оптимизированными для культивирования эмбриона для минимизации повреждений.

В дополнение к этому процедурному методу могут быть проведены исследования лекарств, чтобы ответить на извечный вопрос о сигнальном пути и так далее.