Количественное нитевидных актина (F-актин) Puncta на крысиной корковых нейронов

Общая цель данной методики количественного определения пункт F-актина в культивируемых нейронах заключается в представлении полезного метода изучения целостности и когнитивных свойств синаптических структур. Этот метод может помочь в решении ключевых вопросов нейробиологии, касающихся спиногенеза, синаптической пластичности и синаптической стабильности. Основным преимуществом данной техники является предоставление детального протокола получения первичной культуры нейронов с последующей идентификацией и количественным определением пункт F-актина.

Когда цель исследования неизвестна, необходимо оценить общую целостность структур ratia fundantric. Идея данного метода впервые возникла у нас при изучении повреждений нейронов, вызванных такими наркотическими веществами, как кокаин, и токсичными белками ВИЧ, такими как tat и JP 120. За два дня до постановки культуры нанесите на 12 стеклянных планшетов с дном диаметром 35 мм по 2 мл рабочего раствора поли-L-лизина. Храните планшеты в ламинарном шкафу в течение ночи для поддержания стерильности.

На следующий день удалите средство для покрытия и промойте чашки дважды дистиллированной водой. Дайте чашкам высохнуть в течение одного часа под вытяжным шкафом. Затем перенесите по 2 mL среды для посева в каждую чашку.

Инкубируйте чашки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. В день проведения культуры поместите извлеченный мозг в чашку Петри с холодным HBSS. Затем, зафиксировав мозг пинцетом, с помощью изогнутого пинцета разделите полушария и удалите мозговые оболочки.

Выделите фронтальную кору и перенесите фрагменты в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте в пробирку 2 мл свежего HBSS и 20 µL трипсина-ЭДТА, затем инкубируйте нейральные ткани в течение 10–15 минут при комнатной температуре, осторожно перемешивая содержимое круговыми движениями каждые несколько минут.

По окончании инкубации с помощью стеклянной пипетки аспирируйте весь старый HBSS. Промойте кору дважды свежим HBSS. После второго промывания погрузите ткань в ингибитор трипсина.

Тщательно перемешайте и оставьте образец на пять минут при комнатной температуре. Затем дважды промойте ткани свежим HBSS. Теперь с помощью стеклянной пипетки с резиновой грушей очень медленно тритурируйте кусочки мозга от 10 до 15 раз.

Затем, используя откалиброванную пипетку с установленным стерильным наконечником с уменьшенным диаметром, очень медленно снова тритурируйте тканевую суспензию. Когда раствор станет гомогенным, высейте клетки с соответствующей плотностью в предварительно покрытые культуральные чашки для инкубации в течение ночи в инкубаторе для культур клеток. Через 24 часа замените среду для посева на свежеприготовленную полную узкоспециализированную базальную среду для роста без сыворотки.

Поместите клетки обратно в инкубатор для культивирования клеток минимум на 12–14 дней. Посев с низкой плотностью важен для визуализации отдельных нейронов. Кроме того, использование базальной среды для нейронов имеет решающее значение для минимизации пролиферации астроцитов в клеточных культурах.

Для маркировки клеток при проведении иммуноцитохимического анализа сначала дважды промойте чашку для культивирования клеток с стеклянным дном раствором PBS. Затем зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре. После этого проведите две промывки раствором PBS.

Затем проведите пермеабилизацию клеток с использованием 0,1% раствора Triton X 100 в PBS в течение пяти минут и окрасьте их специфическим красителем на F-актин при комнатной температуре. Через 20 минут дважды промойте клетки PBS и заблокируйте неспецифическое окрашивание поверхности клеток 10% нормальной сывороткой козы. По завершении инкубации проведите overnight-маркировку клеток при 4 °C с помощью поликлональных антител к map2 из кур.

На следующее утро промойте клетки дважды с помощью PBS и подвергните их маркировке соответствующей вторичной антителами. Через два часа при комнатной температуре снова промойте клетки PBS, а затем инкубируйте их с 10 µL huxs в течение трех минут при комнатной температуре. После этого промойте клетки PBS два последних раза и зафиксируйте их, добавив 100 µL антифейдингового реагента.

В течение трех дней после окрашивания включите флуоресцентный микроскоп и выберите объектив 20 X. Далее в программном обеспечении микроскопа установите размер изображения в пикселях 1600 на 1200, разрешение изображения 0.17 micron на пиксель и масштаб 1 X. Перенесите чашку с клетками на предметный столик микроскопа.

Затем получите изображения нейронов, ко-меченных F-актином и Map 2, в зеленом и красном флуоресцентных каналах. После получения всех изображений выберите пять снимков отдельных нейронов в зеленом, красном и синем каналах с четко выраженными дендритными деревьями. Используйте непрерывное иммунофлуоресцентное окрашивание на Map 2 для идентификации структур, богатых F-актином, в дендритных сегментах второго порядка.

Горизонтально отразите выбранную область изображений. Скопируйте и вставьте эту область как новое изображение. Затем вычтите фоновую флуоресценцию изображения и с помощью программного обеспечения подсчитайте количество ярко-зеленых пунктов F-actin.

Используйте обученных независимых наблюдателей для измерения длины выбранных дендритных сегментов. Затем экспортируйте количество пунктов и данные о длине дендритных сегментов в файл электронной таблицы. Убедитесь, что наблюдатели учитывают пункты F-актина с интенсивностью розовой флуоресценции, которая как минимум на 50% превышает среднюю интенсивность окрашивания в дендритном стволе в каждом выбранном сегменте.

Наконец, рассчитайте плотность по формуле, выразив данные как количество пунктат F-актина на десять микрон дендрита. Здесь изображения, полученные методом дифференциального интерференционного контраста, демонстрируют морфологические изменения, наблюдаемые в развивающихся кортикальных нейронах плода крысы с 4-го по 27-й день in vitro. Обратите внимание на увеличение длины и количества дендритов по мере созревания культивируемых первичных нейронов крысы.

Поскольку маркировка F-актина фаллоидином происходит очень быстро, можно визуально оценить целостность синапто-дендритной сети перед тем, как переходить к иммуноцитохимическому мечению антителами. Map2 окрашивает неповрежденные дендриты, подтверждая, что пункты F-актина расположены на нейрональных дендритах, а не локализованы в других клетках, таких как астроциты. На изображениях с высоким разрешением можно наблюдать богатые F-актином структуры, содержащие филоподии, выступы шипиков и патчи F-актина.

В данном эксперименте по оценке синапто-дендритного повреждения, индуцированного HIV 1 tat, окрашивание на Map2 выявило уменьшение количества дендритных ветвей и снижение уровня F-actin в кортикальных нейронах крысы после воздействия HIV 1 tat. Действительно, количество пунктирных структур F-actin увеличивается или уменьшается в ответ на экспериментальное воздействие. Например, в данном эксперименте при обработке культивируемых нейронов неконкурентным антагонистом NMDA-рецепторов мемантином наблюдалось значительное увеличение плотности F-actin-положительных пунктирных структур.

Напротив, обработка комбинацией метамфетамина и белка tat ВИЧ-1 привела к значительной потере пунктов F-актина. После получения изображений высокого разрешения нейронов Map2 с маркированным F-актином, следует поручить двум обученным наблюдателям выбрать сегменты дендритов второго порядка для анализа плотности пунктов. После своей разработки этот метод открыл новые возможности для исследователей в области нейронаук.

Данный метод применим не только для мониторинга острой синаптопатии, но и для изучения восстановления синапсов и процессов экспериментальной нейрорегенерации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как разработать надежный метод измерения целостности синапсов нейронной дендритной сети.